در سال ۱۹۵۲ مورل و مارتین (Morel and Martin) برای حذف ویروس از گل لاله در این ویترو، کشت مریستم را ابداع نمودند. اولین بار جرجز مورل (Georges Morel) در سال ۱۹۶۲ روش کشت نوک ساقه را برای ریزازدیادی نوعی ارکیده از جنس Cymbidium مورد استفاده قرار داد. در دهه ۱۹۷۰ وقتی که موراشیگ مفهوم مراحل نمو را با تعریف مراحل تکثیر، ریشه دهی و مقاوم سازی بیان نمود.
تکثیر کلون در این ویترو پیشرفت قابل ملاحظه ای کرد. این مفهوم در اذهان روشن نمود که یک محیط کشت به تنهایی برای تکثیر گیاهان در این ویترو کافی نیست، بلکه واحد تکثیری جدا شده از گیاه، بایستی به طور متوالی به چند محیط کشت با خصوصیات فیزیکی و شیمیایی ویژه منتقل شود، تا به مرحله باززایی برسد. این روش در گیاهان علفی به دلیل ضعیف بودن غالبیت انتهایی و از طرفی بالا بودن توان ریشه دهی، در مقایسه با گیاهان چوبی بسیار مؤثرتر بوده است. در بسیاری از گیاهانی که امروزه در سطح تجارتی تکثیر می شوند، از این روش استفاده می شود.
مریستم انتهایی
رشد ساقه در تمامی نهاندانگان و بازدانگان برخاسته از ویژگی مریستم انتهایی آن است. مریستم انتهایی، یک بافت قبه مانند با قطر تقریبی ۰/۱ میلی متر و طول تقریبی ۰/۲۵-۰/۰۳ میلی متر می باشد، که در ناحیه انتهایی نوک ساقه قرار دارد. مریستم انتهایی به همراه ۱ تا ۳ پریموردیا، ساختاری به قطر ۰/۵-۰/۱ میلی متر، که همان نوک ساقه است، را تشکیل می دهند.
کشت مریستم انتهایی
در کشت مریستم انتهایی، ریزنمونه از قبه مریستمی انتهایی یا قبه انتهایی به همراه چند پریموردیای برگ موجود در ناحیه زیرین آن گرفته می شود. مریستم یا نوک ساقه یا ایجاد یک برش V شکل با یک چاقوی استریل از ساقه جدا می شود. برای کشت مریستم انتهایی، برشی در فاصله ۰/۵-۰/۳ میلی متر پایین تر از نوک مریستم ایجاد نموده و بافت قطع شده را همراه با مقداری از بافت پیش کامبیومی برداشته و سریعا به محیط کشت منتقل می نمایند.
اندازه ریزنمونه
اندازه ریزنمونه در تعیین موفقیت کشت فاکتور بسیار مهمی است. زمانی که از ریزنمونه های خیلی کوچک استفاده می شود، وجود طرح های آغازین برگ تعیین کننده قابلیت این ریزنمونه ها برای نمو است. بطور کلی یک ریزنمونه بزرگتر شانس بیشتری برای بقاء دارد. عموم محققین بر این عقیده اند که برای ریزازدیادی بایستی ریزنمونه های بزرگی نظیر نوک ساقه را که بیش از ۲ سانتیمتر طول داشته باشند، انتخاب نمود. با این حال، زمانی که هدف تهیه گیاهان عاری از ویروس باشد، فقط بایستی نوک مریستم کشت شود. غالبا از نوک مریستم به طول تقریبی ۰/۵-۰/۴ میلی متر برای تولید گیاهان عاری از ویروس استفاده مینمایند، که این روش به نام کشت مریستم انتهایی معروف است.
اثر مرحله رشدی گیاه بر کشت بافت مریستم و نوک ساقه
همانند تمامی روش های تکثیر غیرجنسی، موفقیت در کشت بافت مریستم و نوک ساقه بستگی به فصلی از سال دارد که ریزنمونه از گیاه مادری جدا می شود. در مورد گونه های گیاهی که از دوره خواب برخوردارند، بهترین نتیجه را زمانی می توان انتظار داشت که گیاه در حال گذران مراحل پایانی دوره خواب خود باشد. علاوه بر این، کشت نوک ساقه های فعال و در حال رشد نیز به دلیل برخورداری از پتانسیل قوی رشد و غلظت کم ویروس، توصیه می گردد.
محیط کشت بافت مریستم
اگرچه در اوایل برای کشت مریستم، در محیط کشت وایت (White) و گاترت (Gauthierrt) بیشترین استفاده را داشتند، اما ترکیب نمکی محیط کشت MS نیز در این نوع کشت ها بسیار رضایت بخش بوده است. هر گونه گیاهی برای رشد به مواد مکمل خاصی در محیط کشت نیاز دارد.
-
موراشیگ گزارش کرد که هر کشت دارای سه مرحله است:
مرحله اول:
در مرحله اول که مرحله انجام کشت می باشد، ریزنمونه ها تولید ساقه های منفرد و یا مجتمع می نمایند. ریزنمونه بافت مریستم، نوک ساقه یا جوانه، از محتوی سیتوکینین کافی برای طی مراحل رشد و نمو به طور طبیعی برخوردار نیست. بنابراین در این مرحله سیتوکینین هایی نظیر BA (بنزیل آدنین)، کینتین و ۲ip بعنوان مواد مکمل به محیط کشت افزوده می شوند. از طرفی، اکسین هورمون مورد نیاز دیگری برای رشد ساقه است، اما از آنجا که نوک ساقه جوان، خود مکانی فعال در بیوسنتز هورمون اکسین است، در این مرحله، بویژه زمانیکه ریز نمونه های مورد استفاده از نوک ساقه های گیاهان فعال در حال رشد و با بزرگترین اندازه ممکن تهیه شده باشند، نیازی به افزودن اکسین به محیط کشت نیست.
اگر قرار باشد هورمون اکسین اضافه شود، بایستی از انواع ضعیف تر آن مانند NAA و IBA با غلظت معمول ۰/۴۵ تا ۱۰ میکرومول استفاده شود. بسیاری از گیاهان غنی از ترکیبات پلی فنلی هستند. پس از صدمه دیدن بافت در حین جداسازی ریزنمونه، این ترکیبات با فعالیت پلی فنول اکسیدازها اکسید شده و موجب قهوه ای با سیاه شدن بافت مزبور می گردند. محصولات این اکسیداسیون فعالیت آنزیمی را متوقف نموده، ریزنمونه را می کشند و همچنین موجب تیره شدن بافت ها در محیط کشت می شوند که این امر تثبیت ریزنمونه را به شدت تحت تأثیر قرار می دهد.
برای غلبه بر این مشکل، بعضی از روش های مورد استفاده توسط محققین مختلف به قرار زیر می باشد:
ا- افزودن آنتی اکسیدان هایی نظیر اسید اسکوربیک، اسید سیتریک، پلی وینیل پیرولیدین (PVT)، دی نیوتریتول، آلبومین سرم گاوی و نظایر آنها به محیط کشت
۲- خیساندن ریزنمونه در مواد آنتی اکسیدان قبل از انتقال به محیط کشت
٣- قرار دادن مرحله آغازین کشت اولیه در محیطی با شدت نور کم و یا در تاریکی، چون مواد حاصل از اکسیداسیون ترکیبات فنلی در روشنایی تولید می شوند.
۴- انتقال مکرر ریزنمونه به محیط کشت جدید به محض مشاهده رنگ قهوه ای در محیط کنت.
مرحله دوم:
در مرحله دوم، هدف تکثیر پروپاگول است که برای این منظور از تکثیر ساقه های جانبی استفاده می شود. دلیل استفاده از این روش این است که ثبات ژنتیکی گیاه والد حفظ می شود و تولید ساقه های جانبی در بیشتر گیاهان نسبت به روش های اندام زایی و جنین زایی راحت تر است.
در تکثیر ساقه های جانبی برای غلبه بر غالبیت انتهایی و افزایش تولید ساقه در زاویه دمبرگ ها، مقدار زیادی هورمون سیتوکینین مورد استفاده قرار می گیرد. سیتوکینین با غلظت های متفاوتی استفاده می شود، بطوریکه به مقادیر ۴/۵ تا ۲۵ میکرومول و بیشتر هم بکار رفته است. بطور کلی BA موثر ترین سیتوکینین مورد استفاده می باشد و کینتین و ۲ip در درجات بعدی قرار دارند. افزودن هورمون اکسین، روند تکثیر ساقه های جانبی را تسریع نمی نماید، اما اگر به مقدار کم استفاده شود، اثر بازدارنده مقادیر زیاد سیتوکینین بر رشد طولی ساقه های جانبی را خنثی نموده و روند رشد ساقه ها را به وضعیت عادی برگشت می دهد.
مرحله سوم:
در مرحله سوم، هدف باززایی ریشه های نابجا از ساقه های بدست آمده از مرحله ۲ و یا در بعضی موارد از مرحله ۱ می باشد. معمولا ساقه هایی که در محیط کشت تولید شده و از طول کافی برخوردارند را جدا نموده و آنها را به محیط کشتی که محتوی اکسین است، انتقال می دهند. برای رویش ریشه های جدید به مقدار کمی سیتوکینین و مقدار زیاد اکسین نیاز است. از آنجا که نیاز هورمونی محیط کشت در این مرحله کاملا برعکس مرحله دوم است، بنابراین در مرحله ریشه دهی بندرت از محیط کشت مرحله ساقه دهی استفاده می شود.
تحقیقات بسیاری نشان داده است که NAA و بعد از آن توفوردی، IAA ،IBA و سایر اکسین ها در القاء ریشه دهی موفق بوده اند. در بسیاری از گیاهان بدلیل تولید اکسین در ساقه های جوان، نیازی به افزودن این هورمون به محیط کشت نبوده و در چنین مواردی بایستی از افزودن اکسین اجتناب شود، زیرا مقادیر زیاد اکسین باعث القاء تولید بافت کالوس می شود. در بعضی موارد اگر ریشه ها، صرفنظر از نوع هورمون موجود، قادر به ظهور در محیط کشتی با محتوی نمکی زیاد نباشند، آنگاه بایستی غلظت نمک های محیط کشت را به یک دوم ، یک سوم و یا یک چهارم مقدار استاندارد تقلیل داد.
شرایط بهینه برای انکوبه کردن متغیر است، اما معمولا کشت ها را در محدوده دمایی ۲۰-۲۸ درجه سانتیگراد و اغلب در دمای ۲۴ – ۲۶ درجه سانتیگراد نگهداری می کنند. شدت و مدت تابش نور مورد نیاز نیز بسته به گونه گیاه متفاوت است، اما معمولا ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی استفاده می شود. نور معمولا با شدت ۱۰-۱ کیلو لوکس تابانده می شود. برای بافت هایی که مشکل قهوه ای شدن دارند، تابش نور با شدت کمتر بهتر است.
دیدگاهتان را بنویسید