تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
لکه گذاری-بلاتینگ-DNA

تکنیک لکه گذاری یا بلاتینگ DNA

  • تکنیک لکه گذاری یا بلاتینگ DNA: ژل های آگاروز که معمولا برای تفکیک DNA هضم شده مورد استفاده قرار می گیرند، بسیار شکننده اند و نمی توان به راحتی با آنها کار کرد. علاوه بر این ژل های آگاروز را به مدت محدودی می توان نگهداری کرد. در این مدت نیز باندهای DNA تفکیک شده بر روی ژل تحت تأثیر انتشار، محو و غیر قابل استفاده می شوند.

    پژوهشگران همواره مایل بودند بتوانند با روش هایی، DNA تفکیک شده را با همان آرایشی که بر روی ژل قرار دارند، حفظ کنند و در صورت نیاز آن را مورد استفاده قرار دهند. در سال ۱۹۷۷ پژوهشگری به نام سادرن روشی را ابداع کرد که به کمک آن می توان مولکول های DNA را به یک غشای باردار نایلونی منتقل نمود. در این روش مولکول های DNA دقیقا با همان آرایشی که بر روی ژل قرار دارند، به غشاء منتقل می شوند.

    فرآیند انتقال سادرن در تکنیک لکه گذاری یا بلاتینگ DNA

    در فرآیند انتقال سادرن، ابتدا DNA هضم شده با اندازه های مختلف توسط الکتروفورز جدا شده. سپس به کمک مواد قلیلیی تک رشته ای شده و در نهایت از طریق عمل مویی یا تحت خلاء به غشاء منتقل می شوند. کارایی انتقال DNA از ژل به غشاء به طول قطعه ها و مدت زمان انجام انتقال سادرن بستگی دارد. به طوریکه قطعه های کوچکتر سریعتر منتقل می شوند، در حالی که قطعه های بزرگ تر نیاز به زمان بیشتری دارند.

    البته کارایی انتقال قطعه های بزرگ تر را می توان با شکستن این قطعه ها به قطعه های کوچکتر تسریع کرد. این عمل با استفاده از اسید کلریدریک به سادگی امکان پذیر است. البته باید توجه داشت که شکستن مولکول های DNA تفکیک شده، در درون ژل آگاروز و بلافاصله پیش از انتقال به غشاء صورت می گیرد. بنابراین با وجود قطعه قطعه شدن مولکول های DNA، محل استقرار آنها بر روی ژل و بر روی غشاء تغییری نمی کند.

    بلاتینگ-DNA

    در انتقال سادرن ضروری است که مولکول DNA پیش از انتقال تک رشته ای شود. DNA تک رشته ای پس از انتقال بر روی غشاء، آماده ایجاد پیوند هیدروژنی با هر قطعه DNA مکمل تک رشته ای است. تک رشته ای کردن مولکول DNA معمولا در حین عمل انتقال و با استفاده از محلول قلیایی مانند سود سوزآور صورت می گیرد.

    روش های انتقال DNA به غشاء در تکنیک لکه گذاری یا بلاتینگ DNA

    روش های متفاوتی برای انتقال DNA به غشاء وجود دارد که عمده ترین آنها عبارتند از:

    1. انتقال از طریق پدیده مویینگی
    2. انتقال از طریق خلاء
    3. انتقال الکتریک

    غشاء-بلاتینگ-DNA

    ۱- انتقال از طریق پدیده مویینگی در تکنیک لکه گذاری یا بلاتینگ DNA

    انتقال از طریق عمل مویی ارزان است و برای بسیاری از کاربردها کافی است. انتقال DNA در این روش بسته به اندازه آن ممکن است ۳تا ۱۸ ساعت به طول بینجامد. این روش شامل حرکت رو به بالای DNA از ژل به غشای نایلونی یا نیتروسلولوزی است. در حقیقت همزمان با عبور بافر از بین ژل، قطعه های DNA نیز به سمت غشا حرکت می کنند.

    زمان لازم برای انتقال، به اندازه DNA بستگی دارد. به طوری که انتقال قطعه های کمتر از یک کیلو باز تقریبا در یک ساعت و قطعه های بیشتر از ۱۵ کیلو باز بیش از ۱۸ ساعت زمان می برد. البته بهبودهایی در روش انتقال مویی صورت گرفته است. مانند استفاده از سیستم توربو بلاتر که در آن عمل لکه گذاری روبه پایین صورت می گیرد. در این روش حدود ۹۰ درصد انتقال DNA ها در یک ساعت امکان پذیر خواهد بود.

    ۲- انتقال از طریق خلاء

    در روش انتقال به کمک خلأ ژلی که در تماس با فیلتر غشایی است، در اتاقک خلأ گذاشته می شود. بافر در اثر خلا از بالای اتاقک به سمت غشا کشیده می شود و DNA ها را برروی غشا قرار می دهد. کارایی و سرعت این روش از روش انتقال از طریق عمل مویی بیشتر است.

    ۳- روش انتقال الکتریک

    روش انتقال الکتریک، فقط برای غشاءهای نایلونی قابل استفاده است. انتقال DNA ها در یک محیط الکتروشیمیایی صورت میگیرد. به طوری که غشای نایلونی در سمت الکترود مثبت (DNA ها به این سمت حرکت می کنند) قرار داده می شود و اتصال الکتریکی بین دو الکترود برقرار می گردد.

    غشاءهای مورد استفاده برای انتقال مولکول های DNA

    غشاهای مورد استفاده در تکنیک لکه گذاری یا بلاتینگ DNA سطح باردار مثبت دارند. در نتیجه گروه های فسفاتی موجود بر روی مولکول های DNA دارای بار منفی هستند. مولکول های DNA به محض انتقال از روی ژل به غشاء با آن پیوند یونی ایجاد می کنند. این غشاء انواع مختلفی دارد و به صورت تجاری نیز در دسترس است.

    غشاء را می توان به همراه DNA تثبیت شده بر روی آن به مدت بسیار زیادی نگهداری نمود. و در زمان مورد نظر آن را برای عمل دورگ گیری DNA-DNA مورد استفاده قرار داد. غشاهای مورد استفاده در روش سادرن متفاوت اند. به طوری که می توان از غشای نیتروسلولوزی، نایلونی و یا پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) استفاده کرد.

    غشاء-نیتروسلولوزی-بلاتینگ

    • غشای نیتروسلولوزی

    معمولا از غشای نیتروسلولوزی، هم برای انتقال اسید نوکلئیک و هم پروتئین استفاده می شود. البته توصیه می شود که از آن برای انتقال اسید نوکلئیک استفاده نشود. زیرا امکان جدا شدن اسید نوکلئیک ها در جریان دورگ گیری و شستن وجود دارد. همچنین نیتروسلولوز وقتی خشک شود بسیار شکننده می گردد. از طرف دیگر دورگ گیری مجدد و استفاده از یک کاوشگر دیگر بر روی همان غشا در غشاهای نیتروسلولوزی بسیار سخت است.

    • غشای نایلونی

    غشای نایلونی برای انتقال اسید نوکلئیک ها مناسب تر است. زیرا دوام آنها نسبت به غشاهای نیتروسلولوزی بیشتر بوده و قابلیت استفاده دوباره از کاوشگر بر روی همان غشاء را نیز داراست.

    • پلی وینیلیدین دی فلوراید

    پلی وینیلیدین دی فلوراید یک پلیمر فلوروکربن با ظرفیت بانددهی غیر اختصاصی آبگریزی است و به طور عمده برای انتقال پروتئین سفارش می شود.

    منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.