معرفی تکنیک DDRT-PCR یا RT-PCR افتراقی
معرفی تکنیک DDRT-PCR یا RT-PCR افتراقی که در سال ۱۹۹۲ توسط لیانگ و پادری مطرح گردید، روش مناسبی برای بررسی تظاهر ژن هاست. در حقیقت این روش یک روش انگشت نگاری برای شناسایی و مقایسه mRNAهای بیان شده در طول مراحل مختلف سلول است. برای مثال روش بسیار مفیدی برای شناسایی ژن هایی است که در بافت های خاص مانند بافت های سرطانی در واکنش به دارو یا آلودگی ویروسی تظاهر می یابند. همچنین روش مفیدی برای شناسایی mRNA هایی است که در شرایط استرس و شوک ایجاد می شوند.
مراحل تکنیک DDRT-PCR یا RT-PCR افتراقی
RT-PCR افتراقی دارای مراحل زیر است:
مرحله اول- رونوشت برداری معکوس از RNAهای جدا شده از نمونه های مختلف
شامل رونوشت برداری معکوس از RNAهای جدا شده از نمونه های مختلف، به کمک گروهی از آغازگرهای قلاب شده، به منظور تهیه cDNA است. برای این منظور از یک آغازگر قلاب شده که عمدتا دارای یک الیگونوکلئوتید پلی آبا یک یا چند نوکلئوتید اضافی (مانند T12AC) است، استفاده می شود. این آغازگرها به انتهای پلیA mRNA را متصل می گردند و cDNA حاصل را به انتهای ‘۳ RNA قلاب می کنند. RAP-PCR که در آن از آغازگرهای اختیاری برای رونوشت برداری معکوس استفاده میگردد. در نتیجه این آغازگرهای ۱۰ نوکلئوتیدی ممکن است به ردیف مکمل بچسبند و رونوشت برداری معکوس را از هر مکانی در طول RNAهای رونوشت می توانند شروع کنند).
معرفی تکنیک DDRT-PCR یا RT-PCR افتراقی
مرحله دوم- تکثیر قطعه های رونوشت cDNA
پس از انجام رونوشت معکوس از نخستین رشته cDNA، با استفاده از جفت آغازگرهای PCR (شامل آغازگر قلاب شده و آغازگر اختیاری) قطعه های رونوشت cDNA تکثیر می شوند. آغازگر رو به جلو مورد استفاده در روش RT-PCR افتراقی، مانند روش RAP-PCR از نوع آغازگرهای اختیاری (معمولا ۱۰ نوکلئوتیدی) است. این آغازگر به همراه آغازگر قلاب شده، cDNA را به وجود می آورند. در حالی که در روش RAP-PCR هر دو نوع آغازگر مورد استفاده اختیاری اند.
لیانگ و پادری (۱۹۹۲) اتخمین زدند که با به کارگیری ۲۴۰ ترکیب آغازگری جفتی منحصربه فرد (برای مثال، همه ترکیب های ممکن از ۲۰ آغازگر اختیاری و ۱۲ آغازگر قلاب شده) تمامی mRNA موجود در نمونه قابل نشان دادن خواهند بود.
مرحله سوم- نشاندار شدن محصولات PCR و رویت آنها
محصولات PCR توسط نوکلئوتیدهای نشاندار با مواد پرتوزا و یا به کمک آغازگرهای نشاندار فلوروسنت نشاندار خواهند شد. پس از الکتروفورز ژل پلی آکریلامید، محصولات قابل رویت می شوند. از راه مقایسه شدت نسبی باندهای ایجاد شده از آزمایش های مختلف امکان ارزیابی وجود خواهد داشت. باندهایی که فقط در یک نمونه وجود دارند و یا باندهایی که با شدت نسبی متفاوتی در تیمارهای آزمایشی خود را نشان داده اند، به صورت بالقوه تفاوت و یا تمایز در تظاهر mRNA را نشان می دهند.
معرفی تکنیک DDRT-PCR
مرحله چهارم تکنیک RT-PCR افتراقی
در مرحله آخر تکنیک RT-PCR افتراقی، تعیین ردیف رونوشت هایی است که محصول متمایزی را نشان داده اند و همچنین تایید صحیح بودن تمایز نشان داده شده است.
راهکارهای متفاوتی برای تایید نتایج این روش وجود دارد که از آن میان می توان تکثیر مجدد محصول PCR مورد نظر (متمایز) و استفاده از آن به عنوان کاوشگر در دورگ گیری نورتن، تجزیه بلات نقطه ای معکوس، و یا بلات شکاف معکوس، همسانه سازی و ردیف یابی محصولات دوباره تکثیر شده (به منظور طراحی آغازگرهای اختصاصی ژن برای ارزیابی کمیت PCR مربوط به cDNA را نام برد. بدون توجه به موارد لازم برای تایید نتایج روش RT-PCR افتراقی، ردیف یابی قطعه های متمایز شده (ژن های با تظاهر متمایز) برای فهم عملکر ژن (ها) مفید خواهد بود.
معایب تکنیک DDRT-PCR یا RT-PCR افتراقی
باوجود مزایای زیاد روش RT-PCR افتراقی، این روش معایبی نیز دارد. که مهمترین آنها ایجاد اشتباه مثبت در مرحله PCR است. همچنین از آنجا که قطعه cDNA تکثیر شده عمدتا مطابق با ناحیه انتهای mRNA است. بنابراین شناسایی ژن هایی که تظاهر متفاوت دارند محدود خواهد شد. از این رو تغییراتی در این روش به وجود آمده است که از آن میان، می توان افزایش طول آغازگر مورد استفاده (به جای آغازگرهای ۱۰ نوکلئوتیدی) برای افزایش اختصاصی بودن و تکرارپذیری و همچنین ایجاد تغییر در آغازگرها برای سهولت مراحل همسانه سازی و تجزیه قطعه ها را نام برد.
تکنیک RT-PCR افتراقی
به طوری که PCR در دو مرحله انجام می گیرد:
- در مرحله نخست که شامل چندین چرخه با سختی کم است، عدم جفت شدن کامل بین آغازگر اختیاری و الگوی cDNA را به وفور اتفاق می افتد.
- در مرحله دوم که شامل تعداد بیشتری چرخه PCR با سختی زیاد است، تطابق کامل با آغازگرهای قلاب شده اتفاق می افتد. همچنین از آنجا که ردیف یابی انجام گرفته روی محصولات PCR بیشتر مربوط به ناحیه ترجمه نشده است، با افزایش طول آغازگر محصول PCR بزرگ تری بدست خواهد آمد. به این ترتیب، در نهایت ردیف های طویل تری به دست خواهند آمد که برای بررسی همولوژی از طریق بانک های اطلاعاتی مفید خواهند بود.
منبع : کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.
دیدگاهتان را بنویسید