اندام زایی در شرایط این ویترو

در کشت بافت گیاهی، اندام زایی فرآیندی است که طی آن اندام های گیاهی نظیر ساقه، ریشه، جوانه، گل و غیره تولید میشوند. این فرآیند عبارتست از: تولید اندام ها از نقاطی غیر عادی نسبت به بافت مادری، بر روی یک ریزنمونه سازمان یافته که فاقد مریستم از قبل تشکیل شده می باشد. ساقه ها و ریشه های نابجا از بافت هایی منشأ می گیرند که در حالت طبیعی این اندام ها را تولید نمی نمایند. ساقه های نابجا ساختارهایی متشکل از ساقه و برگ هستند که از بافت های گیاهی در مکان هایی غیر از زاویه برگ منشأ می گیرند.

• نمو گیاه از طریق اندام زایی:

تشکیل اندام ها با منشأ نابجا و یا منشأ مجدد می باشد. گیاه کامل باززایی شده با این روش، یک ساختار یک قطبی می باشد. این گیاه یکسری رشته های پروکامبیومی تولید می نماید که این رشته ها با شیب آوندی گسترش یافته در بافت کالوس و یا شبکه آوندی که از قبل در بافت ریزنمونه وجود داشته است، ارتباط برقرار می نمایند. فرایند اندام زایی از جنین زایی سوماتیکی متداول تر است و در تکثیر کلون به صورت انبوه، پتانسیل خیلی بیشتری دارد.

تولید گیاهان به روش اندام زایی به دو طریق امکان پذیر است:

١- اندام زایی از بافت کالوس با منشأ مجدد

۲- خروج اندام های نابجا بطور مستقیم از ریزنمونه

عوامل موثر بر اندام زایی:

1. فصل سال گیاه
2. سن گیاه
3. وضعیت فیزیولوژیکی گیاه والد

محیط کشت های مناسب اندام زایی:

محیط کشت های مختلفی از جمله B5، MS، وایت و محیط کشت SH برای اندام زایی مورد استفاده قرار می گیرند. محیط کشت MS بر خلاف محیط های دیگر، محتوی مقادیر زیادی نیتروژن آمونیومی می باشد که ممکن است انتقال سلول ها از محیط کشت های وایت، B5، و یا SH به این محیط کشت، با مشکل مواجه گردد.

در روش اندام زایی معمولا از دو نوع کشت سلولی استفاده می شود:

1. کشت توده های سلولی در سطح محیط کشت جامد

2. کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت مایع

کشت سوسپانسیون سلولی معمولا با انتقال قطعه ای از بافت کالوس ترد به درون محیط کشت مایع شروع می شود. سوسپانسیون ها معمولا متشکل از سلول های آزاد و با توده های ۱۰۰-۲ سلولی می باشند. کشت های سوسپانسیونی بایستی حداقل هر هفته یک بار تجدید کشت شوند، در حالی که تجدید کشت کالوس هر ۴-۳ هفته یک بار بایستی انجام شود.

غلظت مواد تنظیم کننده رشد

غلظت مواد تنظیم کننده رشد در محیط کشت برای اندام زایی بسیار مهم است. اسکوگ و میلر در سال ۱۹۵۷ برای اولین بار نقش مواد تنظیم کننده رشد را در اندام زایی نشان دادند. اکسین با غلظت متوسط تا زیاد، اولین هورمون مورد استفاده برای تولید کالوس است. غالبا از هورمون توفوردی که اکسین بسیار نیرومندی است، به تنهایی برای القاء کالوس استفاده می شود.

در بعضی گونه ها غلظت زیاد اکسین و غلظت کم سیتوکینین در محیط کشت، تولید کالوس را افزایش می دهد. سیتوکینین های مورد استفاده، کینتین یا بنزیل آدنین می باشند. بافت کالوس متشکل از گستره وسیعی از انواع سلول های واکوئول دار با تمایز نامنظم است که تعداد کمی سلول های مریستمی در بین آنها پراکنده می باشد.

بافت کالوس

ماهیت بافت کالوس به بافت ریزنمونه و یا بافت هایی که ریزنمونه از آن منشأ گرفته است و همچنین به ترکیب محیط کشتی که برای تولید و نگهداری آن به کار می رود، بستگی دارد. کالوس را می توان با تهیه واکشت های مکرر برای مدت زمان طولانی نگهداشت، اما ترکیب و ساختار آن ممکن است به مرور زمان تغییر کند، چرا که محیط کشت به نفع سلول های معینی عمل نموده و باعث غالب شدن آنها می شود.

انتقال قطعات کالوس به شرایطی که موجب رشد سازمان یافته شود به تشکیل مریستموئیدها که مراکز رشد نیز نامیده میشوند، می انجامد. مریستموئیدها توده های متمرکزی از سلول های شبه کامبیومی هستند که ممکن است به دلیل ظهور سلول های تراکئیدی در مرکز، به آوند نیز مجهز شوند. این توده ها محل تشکیل اندام در بافت کالوس بوده و قادر به تولید ساقه یا ریشه می باشند.

اثر تنظیم کننده های رشد در شکل زایی کالوس

با تغییر مقدار و نوع هورمون ها میتوان مسیر شکل زایی را در این ویترو کنترل نمود. محیط کشت محتوی مقادیر زیاد اکسین، تشکیل کالوس را تحریک خواهد نمود. کاهش مقدار اکسین و افزایش غلظت سیتوکینین نیز برای تولید ساقه از بافت کالوس مرسوم است. در توتون، حضور آدنین یا کینتین در محیط کشت به تسریع روند رشد و تمایز جوانه ها منجر میشود، اما اکسین ها از تشکیل جوانه ممانعت می کند. مرحله بعدی، ریشه دار کردن ساقه های تولید شده می باشد.

جشنواره پاییزه

جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع

همین الآن خرید کنید

اکسین هایی نظیر IBA و IAA به تنهایی و یا در ترکیب با مقادیر اندکی سیتوکینین در تشکیل پریموردیای ریشه مهم هستند. اندام زایی، هم از سوسپانسیون سلولی و هم از کشت های کالوس امکان پذیر است. فقط لازم است سلول ها را از محیط کشت کالوس به محیط کشت خاص باززایی انتقال داده و سپس به طور مرتب آن را در محیط باززایی تجدید کشت نمود.

اندام زایی از بافت کالوس

باززایی گیاه از ریزنمونه کشت شده، مستلزم تولید کالوس های پایه و سپس تمایز جوانه ساقه از این بافت است. ایجاد کالوس و سپس اندام زایی در بسیاری از گیاهان و از ریزنمونه های متعددی نظیر کوتیلدون، هیپوکوتیل، ساقه، برگ، نوک ساقه، ریشه، گل آذین جوان، گلبرگ ها، جنین و غیره در شرایط این ویترو صورت گرفته است.

برای باززایی موفق گیاه در هر گونه یا واریته معین، ممکن است به ریزنمونه خاصی نیاز باشد. ریزنمونه های حاصل از اندام های بالغ و نابالغ را میتوان در تهیه کالوس و سپس باززایی گیاه مورد استفاده قرار داد. با این وجود، معمولا ریزنمونه های دارای سلول های فعال میتوزی، برای تولید کالوس مناسبتر هستند. بافت ها و اندام های نابالغ در کشت این ویترو از نظر مورفوژنتیکی نسبت به بافت ها و اندام های بالغ، انعطاف پذیرترند.

انتخاب ریزنمونه جهت تشکیل کالوس

اندازه و شکل ریزنمونه نیز مهم است. تعداد زیاد سلول در ریزنمونه های بزرگتر، احتمال تثبیت یک کشت بادوام را افزایش میدهد. درصد کمی از سلول های یک ریزنمونه معین در تشکیل کالوس شرکت می نمایند. محل تشکیل کالوس معمولا در سطح پیرامونی ریزنمونه و یا در سطح بریده شده است. بافت کالوس در اثر ایجاد زخم و یا در پاسخ به هورمون های اضافه شده در محیط کشت ایجاد می شود.

برای انتخاب ریزنمونه بایستی اندام های مریستمی نظیر نوک ساقه، جوانه جانبی، گل آذین، ساقه، برگ، دمبرگ و ریشه، بر سایر بافت ها ترجیح داده شوند، زیرا این بافت ها دارای خصوصیات ارزشمندی نظیر خصوصیات کلون، بقاء کشت، سرعت رشد، و خاصیت توتی پوتنسی در کشت های این ویترو می باشند. مریستم ها، نوک ساقه ها، جوانه های جانبی، برگ ها و جنین های نابالغ، به ویژه در غلات، نیز ریز نمونه های خوبی هستند. ریز نمونه هایی نظیر برگ های بالغ، ریشه، ساقه، دمبرگ و اجزاء گل، می توانند با موفقیت برای تولید گیاهچه به روش اندام زایی مورد استفاده قرار گیرند.

تشکیل اندام نابجا به طور مستقیم

بافت های رویشی گیاهان عالی تحت شرایط ویژه قادر به تولید جوانه های نابجا (Advantitious buds) می باشند. جوانه های نابجا آنهایی هستند که مستقیما از یک اندام گیاهی یا یک قطعه متعلق به آن و بدون نیاز به کالوس منشاء می گیرند. تولید ساقه های نابجا به طور مستقیم بر روی ریشه، برگ، فلس های پیاز و سایر اندام های گیاه یکی از روش های مرسوم تکثیر گیاهان است.

در محیط کشت نیز این روش به ویژه برای گیاهان علفی مناسب می باشد. به عنوان مثال در بگونیا جوانه ها در حالت عادی در امتداد برگ تولید می شوند، اما در یک محیط کشت محتوی BAP جوانه های فراوانی در انتهای بریده برگ تولید می گردد، بطوریکه سطح بریده برگ از جوانه های ساقه پوشیده می شود.

اثر تنظیم کننده های رشد برای تشکیل جوانه نابجا

تسریع در تشکیل جوانه ها با استفاده از هورمون سیتوکینین در چندین گونه گیاهی به ثبت رسیده است. با این وجود، مقدار اکسین و سیتوکینین مورد نیاز از منبع خارجی در این فرایند بر حسب نوع بافت مورد نظر متغیر است، که این امر ظاهرا به مقادیر درونی این هورمون ها در بافت مربوط بستگی دارد.

در روش های این ویترو نیز عمل مشابهی بر روی ریز نمونه ها اعمال میشود و در بعضی گونه ها تولید ساقه ممکن است به طور خود به خود در یک محیط کشت فاقد هر نوع ماده تنظیم کننده رشد رخ دهد، اما در اغلب گونه ها افزودن هورمون های رشد به محیط کشت برای شروع تشکیل ساقه لازم است. دو نوع مهم از مواد تنظیم کننده رشد، یعنی اکسین ها و سیتوکینین ها بسته به نوع ریزنمونه، سن گیاه و شرایط رشد با نسبت های مختلف مورد استفاده قرار می گیرند. باززایی نابجا در شرایط این ویترو ممکن است ساقه های بسیار بیشتری نسبت به روش تکثیر ساقه های جانبی تولید نماید. تکثیر ساقه های نابجا پرکاربردترین تکنیک در سیستم ریزازدیادی است.

منبع:  کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.

رسول رحیم پور