تاریخ :۱۰ فروردین ۱۴۰۳
PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR)

PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR)

  • PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR)

    در سال ۱۹۹۳ الیگونوکلئوتیدهای مکمل ریزماهواره به عنوان تک آغازگرها در PCR ژنوم، توسط می یر و همکاران مطرح شد و PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR) نام گرفت. گوبتا در سال ۱۹۹۴ این روش را واکنش تکثیر تک آغازگر (SPAR) نام نهاد. این نوع نشانگرها در گروه PCR مستقیم ریزماهواره از طریق آغازگرهای قلاب نشده (لنگر نشده) قرار میگیرند.

    توضیح تکنیک MP-PCR

    در این روش از الیگونوکلئوتیدهای تصادفی (هر یک برای یک SSR خاص) استفاده می شود. بنابراین اگر دو ریزماهواره در دو جهت عکس در فاصله قابل تکثیر (۲ تا ۳ کیلو جفت باز) قرار گرفته باشند، ردیف بین دو ناحیه تکرار شونده تکثیر خواهد شد. محصولات تکثیری در ژل های آگاروز با وضوح کم با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید یا در ژل های با وضوح زیاد از طریق رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید و یا رنگ آمیزی نقره یا از طریق نشاندار کردن با مواد پرتوزا، با اتورادیوگرافی قابل بررسی و مشاهده خواهند بود.

    نکته قابل توجه این است که فقط آغازگرهایی که سه، چهار یا پنج نوکلئوتید تکرار شونده دارند، در روش MP-PCR کارایی خوبی را نشان میدهند. در حقیقت آغازگرهای با ردیف تکرار شونده دو نوکلئوتیدی احتمالا به دلیل وجود تعداد زیاد ردیف تکرار شونده دوتایی در ژنوم، لکه یا اسمیر ایجاد می کنند.

    PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR)

    PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR)

    ویژگی تکنیک PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای

    در انگشت نگاری DNA در گیاهان و حیوانات، از الیگونوکلئوتیدهای با ردیف های تکرار شونده کوتاه (انواع مختلف ریزماهواره ها) به عنوان آغازگرهای ژنتیک، به وفور  استفاده می شود. این نوع واکنش ها به صورت چند تایی هستند. یعنی می توان چندین جایگاه ژنی ژنوم را در یک واکنش PCR آشکار کرد. آغازگرهای مبتنی بر SSR بیشتر به صورت ردیف های تکرار شونده سه، چهار و پنج نوکلئوتیدی هستند و الگوهای بانددهی قابل تفکیک را ایجاد می کنند. در این مورد به جز ردیف SSR که به عنوان آغازگر استفاده می شود، نیازی به داشتن اطلاعات در مورد ردیف DNA وجود نخواهد داشت.

    تعداد قطعه های تکثیر شده توسط تکنیک PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR)، به فراوانی تکرارهای آغازگر در ژنوم هدف بستگی دارد. در انسان تخمین زده شده است که یک ردیف دو نوکلئوتیدی به طور متوسط در هر ۳۰ تا ۵۰ کیلو باز و ردیف سه نوکلئوتیدی به طور متوسط در هر ۳۰۰ تا ۵۰۰ کیلو باز اتفاق می افتد. در حالیکه این فراوانی در گیاهان کمتر است. همچنین مقدار چند شکلی که مشاهده می گردد، به تنوع ژنومی در داخل گونه ها و غالب یا همبارز بودن چند شکلی های ایجاد شده بستگی دارد.

    در مورد نشانگرهای RAPD، چند شکلی های غالب به دلیل اختلاف در عدم جفت شدن آغازگر و جایگاه هدف، و چند شکلی های همبارز به دلیل ازدیاد یا حذف در ناحیه بین جایگاه های اتصال آغازگر است. برخلاف نشانگرهای RAPD در MP-PCR چند شکلی های همبارز را می توان به اختلاف در طول SSR در جایگاه هدف نسبت داد. علاوه بر این واکنش های MP-PCR نسبت به واکنش های رپید به دلیل طویل تر بودن آغازگر های مبتنی بر PCR (۱۵ تا ۲۰ نوکلئوتید) اختصاصی تر عمل می کنند. از این رو سختی واکنش و همراه است تکرارپذیری بیشتری دارند.

    جشنواره پاییزه
    جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع
    همین الآن خرید کنید

    مشکلات استفاده از PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR)

    ۱- مشکلات مربوط به تکرار پذیری و اختصاصی بودن آغازگر: مطالعات مختلف نشان می دهد که با وجود دمای زیاد اتصال آغازگرهای واکنش MP-PCR، تکرار پذیری و همچنین کیفیت الگوهای بانددهی آنها به شدت تحت تاثیر غلظت آغازگر، منیزیم و همچنین درجه حرارت اتصال است. همچنین در برخی از موارد جفت شدن ناقص آغازگر نیز اتفاق می افتد. به دلیل چنین مشکلاتی شناسایی بهترین درجه حرارت اتصال به صورت تجربی به منظور به دست آوردن بیشترین تکرار پذیری و همچنین استفاده از تکینک Touch down-PCR پیشنهاد می شود. شایان ذکر است که اگرچه الگوهای بانددهی در استفاده از این نوع PCR تکرارپذیرترند، ولی مقدار چند شکلی کمتری را نسبت به پروفیل معمول و دمای اتصال ثابت ایجاد می کنند.

    مشکلات استفاده از PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای

    مشکلات استفاده از PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای

    ۲- مشکل دیگر در استفاده از تکنیک PCR با استفاده از آغازگرهای ریزماهواره ای (MP-PCR) این است که آغازگرهای دو نوکلئوتیدی و همچنین آغازگرهای سه نوکلئوتیدی غنی از AT قطعه های مجزا و واضحی را ایجاد نمی کنند. در حقیقت به دلیل آنکه آغازگر قلاب نشده می تواند با تعداد زیادی از نواحی در جایگاه هدف اتصال یابد، بنابراین از هر جایگاه ژنی تعداد زیادی محصولات ناخالص ایجاد خواهد شد.

    منبع : کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵

    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *