تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
تکنیک های استریلیزاسیون کشت بافت گیاهی

تکنیک های استریلیزاسیون کشت بافت گیاهی

  • ۱- استریلیزاسیون توسط بخار

    بیشتر محیط های غذایی را با استفاده از اتوکلاو استریل می کنند. شرایط استاندارد برای اتوکلاو کردن محیط کشت ها، دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار psi ۱۵ به مدت ۲۰ دقیقه می باشد. این شرایط برای لوله های آزمایش با سایر ظروفی که محتوی ۵۰-۲۰ میلی لیتر محیط کشت هستند، اعمال می شود. اتوکلاو دارای محدوده دمایی ۱۱۵ – ۱۳۵ درجه سانتیگراد می باشد. در یک استریلیزاسیون صحیح توسط اتوکلاو، فاکتورهای زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده ای که بایستی استریل شود، مورد توجه قرار گرفته و از راهنمای زیر بایستی پیروی شود:

    •  لوله های آزمایش و ظروف محتوی ۵۰-۲۰ میلی لیتر محیط کشت، به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار psi ۱۵
    • ظروف محتوی ۵۰۰-۵۰ میلی لیتر محیط کشت، به مدت ۲۵ دقیقه در دمای ۱۲۱  درجه سانتیگراد و فشار psi ۱۵
    • ظروف محتوی ۵۰۰۰-۵۰۰ میلی لیتر محیط کشت، به مدت ۳۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار psi ۱۵

    میزان نفوذ گرما در اتوکلاو کردن بسیار حائز اهمیت است. بنابراین حجم های زیاد را بایستی در مدت زمان بیشتری استریل کرد، چون در حجم های زیاد مدت زمان بیشتری طول می کشد تا گرما در تمام محیط کشت رسوخ کند. برای استریل کردن بطری ها در هنگام اتوکلاو بایستی سر آنها شل باشد. پس از اتوکلاو نمودن، بطری ها به لامینار ایرفلو منتقل شده و پس از خنک شدن، سر آنها را محکم می بندند.

    • مزایای اتوکلاو

    سرعت و سهولت استریل کردن و از بین بردن ویروس ها

    • معایب اتوکلاو

    ۱- اثرات مضر بر ماده استریل شده

    ۲- تغییری معادل ۰/۳ تا ۰/۵ واحد در pH

    ۳- جدا شدن اجزاء از هم و وقوع واکنش های شیمیایی است، که منجر به از بین رفتن فعالیت اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت می شود.

    • واحدهای انرژی و فشار

    واحد پوند بر اینچ مربع (psi)، بیشترین کاربرد را دارا است، اما می توان واحد ژول بر کیلوگرم ( J/kg) را نیز که بیان انرژی بر واحدی از یک توده می باشد، بکار برد.

    واحد پاسکال برای بیان فشار به کار می رود که یک ژول بر کیلوگرم معادل یک کیلوپاسکال است. بنابراین ۱ پوند بر اینچ مربع برابر با ۶/۹ کیلوپاسکال و در نتیجه ۱۵ پوند بر اینچ مربع برابر با ۱۰۵ کیلوپاسکال می باشد.

    در طی مدت اتوکلاو کردن و پس از آن موارد زیر بایستی مد نظر قرار گیرد:

    ۱- pH محیط به اندازه ۰/۳ الی ۰/۵ واحد، کاهش می یابد

    ۲- اتوکلاو در دماهای خیلی زیاد می تواند موجب سوختن قندها و تولید مواد سمی شود.

    ۳- استفاده از اتوکلاو می تواند باعث تخریب مواد فرار شود.

    ۴- اتو کلاو برای مدت طولانی می تواند موجب رسوب نمک ها و تجزیه آگار شود.

    ۵- بایستی دقت شود که از زمان و درجه حرارت صحیح استفاده شود.

    ۲- استریلیزاسیون خشک

    • شیشه آلات و ابزار آلات فلزی در گرمای خشک به مدت ۳ ساعت و دمای ۱۶۰- ۱۸۰ درجه سانتیگراد استریل می شوند. گرمای خشک در دمای ۱۶۰ درجه سانتیگراد به مدت ۲ ساعت معادل گرمای مرطوب (بخار) در دمای ۱۲۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه است.
    • وسایل خشک اعم از ابزار آلات و شیشه آلات خالی را می توان در ورقه های آلومینیومی پیچید و یا در ظروف فلزی درب دار قرار داد و سپس استریل نمود تا پس از سرد شدن به مدت زیادی در وضعیت استریل باقی بمانند.

    اتوکلاوهای امروزی، هم به استریلیزاسیون خشک و هم به استریلیزاسیون مرطوب مجهز می باشند. اگر مواد خشک، یعنی ابزار آلات، شیشه آلات، پیپت ها، اجسام نوک تیز و غیره، بایستی استریل شوند، اتوکلاو را با سیکل خشک بکار می برند. برای استریل کردن مواد مایع (محیط کشت ها و آب)، استریلیزاسیون مرطوب (بخار) در اتوکلاو یا دیگ زودپز خانگی صورت می گیرد. البته وجود سوپاپ اطمینان، در این حالت الزامی است. از دیگ زودپز خانگی برای استریل کردن مقادیر کم محیط کشت، می توان استفاده کرد.

    ۳- استریلیزاسیون توسط فیلتر

    برخی فاکتورهای رشد، اسیدهای آمینه، ویتامین ها و توکسین ها در مقابل حرارت ناپایدارند و در طی اتوکلاو کردن به همراه مابقی محیط کشت، تخریب می شوند. بنابراین چنین مواد شیمیایی را با عبور دادن از فیلتر هایی با اندازه روزنه ۰/۲۲ تا ۰/۴۵ میکرومتر، استریل می کند. گستره ای از غشاء های ضد باکتری (میلی پور-میلی پور کو، نالجن – نالج کو، فیلترهای سارتوریوس – سارتوریوس و غیره) و تجهیزات مرتبط با آنها برای استریل کردن حجم های مختلف مایعات از ۱ تا ۲۰۰ میلی لیتر در دسترس میباشد.

    جشنواره پاییزه
    جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع
    همین الآن خرید کنید

    اغلب فیلترها از جنس استات سلولز یا نیترات سلولز بوده و در بسته های پلاستیکی از پیش استریل شده، قرار دارند. در طی استریلیزاسیون با فیلتر، تمام ذرات، میکروارگانیزم ها و ویروس هایی که از قطر روزنه های فیلتر بزرگتر باشند، در روی فیلتر باقی مانده و حذف می گردند.

    • کاربرد استریلزاسیون با فیلتر:

    اغلب زمانی است که به یک ماده حساس به حرارت (مثلا X) در محیط کشت (مثلا A) نیاز باشد. در ابتدا محیط کشت مایع بدون ماده X در یک ظرف، اتوکلاو شده و در حالیکه محیط کشت هنوز مایع است و دمایی در حدود ۵۰ درجه سانتیگراد دارد. ماده X توسط سرنگ هیپودرمیکی که به غشا، فیلتری مجهز است، به محیط کشت تزریق می گردد. این عملیات در زیر هود لامینار ایرفلو انجام می شود. محیط کشت محتوی ماده X را به هم زده و در ظروف از قبل استریل شده پخش می کنند. برای استریل کردن حجم های زیاد با استفاده از فیلتر، استریلیزاسیون را می توان با یک دستگاه فیلتر در خلاء انجام داد.

    ۴- استریلیزاسیون با اشعه ماوراء بنفش

    استفاده از اشعه های گاما برای استریلیزاسیون محیط های غذایی به عنوان یک روش رایج در امر تهیه محیط کشت، برای کشت بافت گیاهی با مشکل روبرو است، زیرا این روش در مقایسه با روش استفاده از اتوکلاو بسیار گرانتر است. با این وجود، ظروف پلاستیکی از قبل استریل شده، عموما با تابش اشعه ماوراء بنفش استریل شده اند. محیط کشتی که توسط اتوکلاو استریل شده است در زیر هودهای لامنیار ایرفلو به درون این ظروف استریل ریخته می شود. استفاده از روش پرتوتابی در آزمایشگاه های تحقیقاتی چندان مرسوم نیست.

    حفظ شرایط استریل

    روش ها و تکنیک های زیر در طی یک عمل انتقال استریل به کار می روند:

    ۱- استریلیزاسیون با الکل

    لازم است که دست های محقق در زمان انجام کار، نسبتا ضد عفونی باشند. شستشوی دست ها با یک ماده پاک کننده ضد باکتری و سپس پاشیدن الکل ۷۰٪ بر روی آنها، مؤثر است. بایستی قبل از شروع کار، مقداری الکل ۹۶-۷۰٪، به داخل کابینت لامینار ایرفلو باشید.

    ۲- استریلیزاسیون با شعله

    این روش برای استریل کردن ابزار آلاتی که به طور مداوم در طی کار استفاده می شوند، بکار می رود. این ابزار آلات را در الکل ۸۰-۷۰ درصد فرو برده و سپس روی شعله موجود در زیر هود لامینار ایرفلو می گیرند که این عمل در حین کار در شرایط استریل، مکررا تکرار می شود. حتی اگر ابزارها تحت استریلیزاسیون خشک یا مرطوب هم قرار گرفته باشند، این عمل ضروری است.

    • احتیاط هایی که بایستی مورد توجه قرار گیرد:

    ۱- ۱۵ دقیقه قبل از استفاده، هود را روشن نموده، داخل آن را با الکل ۷۰٪ اسپری کنید و با پنبه استریل آغشته به الکل ۷۰٪ تمییز نمایید

    ۲- پس از اینکه مرحله ای از انجام کار به پایان رسید، ظروف کشت بایستی سریعا پوشیده شوند.

    ٣- از صحبت کردن در زیر هود اجتناب شود و در صورت لزوم سر خود را به سمت چپ با اراست بچرخانید و سپس صحبت کنید، اما دست ها باید در زیر هود باقی بمانند.

    ۴- تمامی مواد اعم از ظروف، محیط کشت ها و غیره در یک سمت کابینت هود استریل قرار داده شوند، به طوریکه در جریان هوا اختلال ایجاد نمایند. مواد نبایستی در مسیر عمل انتقال قرار داشته باشند.

    ۵- به جهت حرکت جریان هوا در هود دقت نمایید و هیچگاه ظروف کشت قبلی با ظروف کشت آلوده را در مسیر جریان هوا به سمت ظروف کشت جدید قرار ندهید. این اشتباه باعث انتقال آلودگی های احتمالی از ظروف کشت آلوده به ظروف تازه میشود.

    ۶- پس از پایان کار، داخل هود را با الکل ۷۰ ٪ اسپری کنید و با پنبه استریل آغشته به الکل ۷۰ درصد تمیز نمایید.

    منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.