تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
اصول-طراحی-آغازگر

اصول طراحی آغازگر در واکنش زنجیره ای پلیمراز

  • اصول طراحی آغازگر در واکنش زنجیره ای پلیمراز

    در ارتباط با اصول طراحی آغازگر در واکنش زنجیره ای پلیمراز باید دانست که آغازگر (Primer) در مهندسی ژنتیک به قطعه ای از DNA تک رشته ای گفته می شود که به صورت سنتتیک توسط دستگاه پلیمریزاسیون DNA، بر اساس ترادف داده شده، سنتز شده و دارای طولی حدود ۲۶-۱۸ نوکلئوتید است. از آغازگر جهت اهداف گوناگونی مانند سنتز بخشی از DNA، همسانه سازی ژن، تعیین جهش ها، تشخیص عوامل عفونی، تشخیص هویت، در زمینه جنایی استفاده می شود.

    اصول طراحی آغازگر در واکنش زنجیره ای پلیمراز

    اصول طراحی آغازگر در واکنش زنجیره ای پلیمراز

    ویژگی های آغازگر مورد استفاده در واکنش زنجیره ای پلیمراز

    آغازگرهای مورد استفاده در PCR ترجیحا باید دارای ویژگی های زیر باشند:

    ۱-طول آغازگر

    یکی از مهمترین عوامل مؤثر در تکثیر PCR طول آغازگرهای مورد استفاده است. اگر طول آغازگرها خیلی کوتاه باشد، امکان اتصال به جایگاه های غیراختصاصی بیشتر می شود و در نتیجه محصول تکثیری نامطلوبی را ایجاد می کند. از طرفی با افزایش طول آغازگر تعداد باندهای مورد انتظار کاهش و اختصاصی بودن آغازگر افزایش می یابد. اگر این افزایش در طول آغازگر خیلی زیاد باشد، سبب عدم اتصال صحیح آغازگرها به جایگاه مکمل خود در رشته DNA الگو می شود و در نتیجه بازده واکنش PCR کاهش می یابد. به طور معمول آغازگرها باید ۲۰ تا ۳۰ نوکلئوتید طول داشته باشند تا بتوانند ردیف هدف خاصی را تکثیر کنند

    ۲- به طور تقریبی دارای تعداد مساوی از هر نوکلئوتید باشند.

    ۳- در هنگام طراحی آغازگر، باید به این نکته توجه نمود که تفاوت طول آغازگر رفت و برگشت نباید بیش از سه نوکلئوتید در نظر گرفته شود. یعنی فاقد بیش از سه نوکلئوتید مشابه تکراری به دنبال هم باشند. زیرا این امر موجب سرخوردن آغازگر در الگو می گردد.

    ۴- منطقه ای از آغازگر که باید کاملا با الگو منطبق باشد، انتهای ˊ۳ است. زیرا این قسمت انتهای آغازگر است که بوسیله آنزیم DNA پلیمراز طویل می شود و بنابراین برای اطمینان از جفت شدن اختصاصی با توالی هدف صحیح، بسیار اهمیت دارد. حداقل باید ۳ نوکلئوتید اول در انتهای ˊ۳ آغازگری با طول ۲۰ نوکلئوتید، کاملا با الگو منطبق باشد. بنابراین تعیین دقیق ترادف های ˊ۳ آغازگر نقش بسزایی در یک واکنش PCR دارد.

    بکارگیری یک نوکلئوتید گوانین و یا سیتوزین در انتهایˊ۳ آغازگر، می تواند تاثیر بسیار خوبی در موفقیت فرآیند PCR داشته باشد.البته در توالی هایی که آغازگرهای آنها دارای انتهایˊ۳ غنی از گوانین یا سیتوزین است، احتمال اتصال اشتباهی افزایش می یابد. بنابراین باید از قرارگیری بیش از سه سیتوزین یا گوانین در انتهای ˊ۳ جلوگیری شود.

    ویژگی آغازگرهای مورد استفاده در واکنش زنجیره ای پلیمراز

    ۵- ردیف های مکمل در انتهای ‘۳ دو آغازگر

    انتهای ‘۳ دو آغازگر باید فاقد ردیف های مکمل باشد. زیرا در صورت وجود ردیف های مکمل امکان اتصال آغازگرها به همدیگر وجود خواهد داشت. در این حالت اتصال دو آغازگر قطعه ای مجازی را ایجاد می کند که می تواند به جای قطعه اصلی تکثیر شود. در بسیاری از حالت ها نیازی نیست که ردیف آغازگر به طور کامل مکمل ردیف الگو باشد. در حقیقت ناحیه ای از آغازگر که باید به طور کامل مکمل الگو باشد انتهای ‘۳ آغازگر است.

    زیرا از این انتها توسعه و پلیمریزاسیون DNA صورت می گیرد. از این رو اتصال درست ناحیه ‘۳ به منظور تکثیر ناحیه صحیحی از DNA ضروری است. در کل، دست کم باید سه نوکلئوتید اول در انتهای ‘۳ به طور کامل با الگو مکمل باشند. در حالی که انتهای ‘۵ آغازگر گاهی اوقات به منظور همسایه کردن، دستکاری های ژنتیک و نوترکیبی یا تظاهر محصولات PCR تغییر داده می شود.

    ۶- تعیین دمای اتصال برای یک جفت آغازگر

    به طور معمول دمای اتصال برای یک جفت آغازگر در یک واکنش پی. سی.آر، ۵۰ تا ۶۲ درجه سانتیگراد در نظر گرفته می شود. نکته بسیار مهم این است که تفاوت دمای اتصال بین یک جفت آغازگر، از ۵ درجه سانتیگراد نباید بالاتر باشد. دمای اتصال باید به میزان کافی پایین باشد تا پرایمر و DNA الگو قادر به اتصال به یکدیگر باشند. از سوی دیگر باید به میزان مناسب بالا باشد تا از تشکیل پیوندهای غیراختصاصی جلوگیری کند.

    یکی از مهمترین مشخصات دمای ذوب (Tm)، وابستگی آن به ترکیب بازی DNA است. گوانین و سیتوزین سه پیوند هیدروژنی، ولی آدنین و تیمین دو پیوند هیدروژنی دارند. بنابراین هر چقدر میزان گوانین و سیتوزین در DNA بیشتر باشد، دمای اتصال بیشتر است. دمای ۳-۴ درجه سانتیگراد کمتر از Tm، برای دمای اتصال مناسب است. زیرا در این دما هیبریداسیون بین پرایمر و DNA یا الگو صورت گیرد.

    دمای-اتصال-آغازگر

    دمای-اتصال-آغازگر

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.