محیط کشت مناسب کشت پروتوپلاست:
نیازهای غذایی پروتوپلاست ها شبیه نیازهای غذایی سلول های گیاهی کشت شده می باشد. با این حال در ترکیبات نمکی مورد نیاز برای کشت سلول های گیاهی، تغییراتی داده می شود تا نیازهای ویژه پروتوپلاست ها را برآورده سازند.
- در محیط کشت پروتوپلاست، از آمونیوم نبایستی استفاده کرد، زیرا برای بقای پروتوپلاست ها مضر است.
- مقدار آهن و روی نیز بایستی کاهش یابد.
- از طرف دیگر غلظت کلسیم را بایستی به ۴-۲ برابر مقدار مورد نیاز محیط کشت های معمولی، افزایش داد. احتمالا غلظت زیاد کلسیم برای ثبات و پایداری غشاء پلاسمایی حائز اهمیت است.
- گلوکز ارجح ترین و مطمئن ترین منبع تامین کربن می باشد. سلول های گیاهی در حضور ترکیبی از گلوکز و ساکارز نیز خوب رشد می کنند، اما ساکارز به تنهایی ممکن است همیشه برای پروتوپلاست های گیاهی رضایت بخش نباشد.
- ویتامین های مورد استفاده در کشت پروتوپلاست ها شامل همان هایی است که در محیط های استاندارد کشت بافت استفاده می شوند. اگر قرار است پروتوپلاست ها با تراکم کم در محیط غذایی معینی کشت شوند، ممکن است به ویتامین اضافی نیاز پیدا شود.
محیط کشت های پروتوپلاست ها غالبا حاوی یک یا چند اسید آمینه می باشند. یک روش ساده و مناسب، اضافه نمودن ۰/۲۵- ۰/۰۱ گاز آمینو اسیدهای عاری از ویتامین یا هیدرولیزات کازئین به محیط کشت است. به نظر می رسد که اگر ازت غیر آلی کافی نباشد، چنین مخلوطی نیازهای پروتوپلاست ها را فراهم نماید. افزودن ۵-۱ میلی مول گلوتامین طبیعی (L – glutamine) میتواند رشد را بهبود بخشد.
-
استفاده از هورمون های رشد در محیط کشت مایع پروتوپلاست
اکثر محیط کشت های پروتوپلاستی حاوی یک یا چند اکسین به همراه یک یا دو سیتوکینین، برای تحریک فرآیندهای رشد و تقسیم پروتوپلاست ها، می باشند. فقط تعداد اندکی از سیستم های پروتوپلاستی می توانند در محیط کشت های فاقد مواد تنظیم کننده رشد، رشد نمایند.
به طور کلی، کشت پروتوپلاست ها با غلظت نسبتا بالایی از اکسین ها، به میزان ۳-۱ میلی گرم بر لیتر توفوردی با NAA به همراه غلظت های کمتری از سیتوکینین ها، به میزان ۰/۱-۱ میلی گرم بر لیتر BAP یا ذاتین، شروع می شود. وقتی که پروتوپلاست ها شروع به تقسیم می نمایند، غالبا توصیه می شود که در محتوی هورمونی محیط کشت تغییراتی صورت گیرد. در اغلب موارد برای تحریک اندام زایی از تغییر در توازن اکسین به سیتوکینین استفاده می شود.
شرایط محیطی مورد نیاز کشت پروتوپلاست:
۱- نور:
معمولا نور شدید، اگر در مراحل آغاز کشت مورد استفاده قرار گیرد، از رشد پروتوپلاست ها ممانعت می نماید. بهتر است که کشت پروتوپلاست را در چند روز اول در تاریکی و یا شدت نوری کم نگهداری نمود و سپس آن را به محیطی با شدت نوری زیاد در حدود ۵۰۰۰-۲۰۰۰ لوکس انتقال داد.
گزارشاتی مبنی بر رشد بهتر پروتوپلاست ها در کشت هایی که تحت شرایط تاریکی مداوم نگهداری شده اند، وجود دارد. بر عکس در مورد حبوبات نشان داده شده است که برای شروع فرآیند تقسیم پروتوپلاست، وجود نور ضروری است.
۲- دما:
به طور کلی کشت های پروتوپلاستی در محدوده دمایی ۲۰ -۲۸°C نگهداری می شوند.
۳- pH:
برای محیط کشت های پروتوپلاستی، pH حدود ۵/۹- ۵/۵ توصیه می شود و به نظر می رسد که این pH رضایتبخش باشد.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید