استریلیزاسیون با مواد شیمیایی
بافت های گیاهی را می توان با انواع مختلفی از مواد شیمیایی استریل کرد. با کمک مواد شیمیایی میکروارگانیسم ها را ریشه کن می کنند. نوع و غلظت ماده استریل کننده مورد استفاده و مدت زمان تماس آن با نمونه گیاهی، به طور تجربی بایستی تعیین شود. بارها مشاهده شده است که تیمار بیش از حد با مواد شیمیایی، فقط منجر به حذف کامل میکروارگانیسم ها نمیشود، بلکه برای بافت گیاهی نیز کشنده است. بنابراین تعیین شرایط بهینه برای هر بافت خاص، اهمیت زیادی دارد:
۱- محلول ۱٪ هیپوکلریت سدیم (NaCIO):
مایع سفید کننده تجارتی، حاوی ۵ درصد هیپوکلریت سدیم است. بنابراین می توان از محلول ۲۰ درصد آن یعنی ۲۰ میلی لیتر مایع سفید کننده حل شده در ۸۰ میلی لیتر آب، برای استریلیزاسیون استفاده نمود.
۲– هیپوکلریت کلسیم Ca (CIO)2:
این ماده بصورت پودر است. به خوبی با آب مخلوط می شود و پس از ته نشین شدن، محلول شفاف رویی برای استریلیزاسیون مورد استفاده قرار می گیرد. معمولا با غلظت ۴ الی ۱۰ گرم بر ۱۰۰ میلی لیتر بکار می رود. هیپوکلریت کلسیم در قیاس با هیپوکلریت سدیم، آهسته تر به بافت گیاهی نفوذ می کند. این ماده را به دلیل طبیعت آبگیری (جذب آب) که دارد، فقط برای مدت زمان کوتاهی می توان ذخیره نمود.
۳- محلول ۱٪ آب برم
۴- محلول ۱-۰/۰۱٪ کلرید جیوه:
این نمک در آب حل می شود. کلرید جیوه برای گیاهان شدید سمی است، بنابراین عمل شستشو باید به طور کامل انجام شود. آب حاصل از شستشو با این ماده بایستی در ظروف برچسب دار جداگانه جمع آوری شده و به خارج از آزمایشگاه منتقل شود.
۵- الکل:
مواد گیاهی را با فروبردن در الکل ۷۰٪، به مدت ۳۰ ثانیه تا ۲ دقیقه استریل می کنند. عموما الکل به تنهایی برای کشتن همه میکروارگانیسم ها کافی نیست و مواد گیاهی پس از تیمار با الکل، با ماده استریل کننده دیگری نیز تیمار می شوند.
۶- پراکسید هیدروژن ۱۰٪
۷- محلول نیترات نقره ۱٪
۸- محلول آنتی بیوتیک به مقدار ۵۰-۴۰ میلی گرم بر لیتر
این مسئله که سطح ریزنمونه به درستی با محلول استریل کننده خیس شود، حائز اهمیت است. غوطه ور کردن نمونه به مدت ۳۰ ثانیه در محلول اتانول ۷۰ درصد و یا اضافه نمودن چند قطره مایع پاک کننده (مانند تیپول و تووین -۲۰) به سایر محلول های شیمیایی استریل کننده در طی عمل استریلیزاسیون، تأثیر عامل استریل کننده را تضمین خواهد نمود. ریزنمونه ها پس از تیمار با مواد شیمیایی، بایستی چند دفعه به طور کامل با آب مقطر استریل شسته شوند، زیرا وجود این مواد شیمیایی مضر، به شدت موجودیت کشت را تحت تأثیر قرار خواهد داد.
دستورالعمل ها
۱ – استریل کردن بذور
- بذور را در یک صافی کوچک چای، کیسه نایلونی سوراخ دار و یا قطعه ای پارچه توری ریخته و با جریان آب گرم بشوئید. اگر بذور خیلی آلوده هستند، ابتدا آنها را در یک ظرف حاوی چند قطره مایع پاک کننده شستشو دهید.
- پس از شستشو، بذور را با الکل ۷۰ ٪ به مدت ۳۰ ثانیه تا ۲ دقیقه تیمار کنید. پس از تیمار، الکل را دور بریزید.
- سپس بذور را با محلول ۲-۱ ٪ هیپوکلریت سدیم که محتوی ۳-۲ قطره تووین ۲۰ (۲۰ Tween) باشد، به مدت ۲۰-۱۰ دقیقه همراه با تکان دادن، تیمار نمایید. در این مرحله می توان بذور را با محلول ۱-۰/۰۱٪ کلرید جیوه به مدت ۱۰-۲ دقیقه و یا محلول ۱۰۰-۱۰٪ اشباع هیپوکلریت کلسیم به مدت ۲۰-۱۰ دقیقه نیز تیمار نمود.
- در زیر هود استریل (لامینار ایرفلو) مواد شیمیایی را دور ریخته و بذور را با آب مقطر استریل ۵ دفعه شستشو دهید.
۲ – استریل کردن جوانه ها، برگ ها، ساقه ها، ریشه ها، غده ها، فلس ها و غیره:
- بافت مورد نظر را به مدت ۳۰ ثانیه تا ۲ دقیقه در الکل ۷۰٪ فرو برید. ریشه ها، غده ها و پیازها بایستی قبل از تیمار با الکل در مایع پاک کننده و جریان ملایم آب کاملا شسته شوند.
- سپس آنها را با محلول ۲۰٪ هیپوکلریت سدیم تجارتی (محتوی ۱ درصد کلرین فعال) به مدت ۱۰-۵ دقیقه تیمار نمایید. غلظت این محلول و زمان تماس آن، بسته به نوع بافت و میزان آلودگی آن می تواند متغیر باشد.
- مواد شیمیایی استریل کننده را در زیر هود استریل دور ریخته و نمونه ها را با آب مقطر استریل، به طور کامل (۵-۳ مرتبه) شستشو دهید.
۳ -استریل کردن بافت ها برای تهیه جنین های نابالغ، تخمک ها و جوانه های گل برای کشت دانه گرده :
- بافت کامل، یعنی تخمدان یا بذور کامل گندم، جو، ذرت، برنج، و غیرو به منظور تهیه جنین نابالغ و جوانه های گل به منظور کشت دانه گرده، استریل می شوند.
- بافت مورد نظر را به مدت ۱۰–۵ دقیقه همراه با تکان دادن در محلول هیپوکلریت سدیم تجارتی ۲۰٪ که محتوی ۳-۲ قطره مایع تووین ۲۰ باشد، غوطه ور کنید.
- در زیر هود استریل، مواد شیمیایی استریل کننده را دور بریزید و بافت ها را کاملا ۵-۳ بار با آب استریل دو بار مقطر بشویید.
- بافت استریل شده را شکاف داده و نمونه گیاهی مورد نظر را خارج نمایید.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم
دیدگاهتان را بنویسید