استریلیزاسیون
استریلیزاسیون روشی است که برای حذف میکروارگانیسم ها استفاده می شود. انجام روش های کشت بافت مستلزم حفظ شرایط ضد عفونی شده با استریل می باشد. تمامی ظروف کشت، محیط کشت ها و وسایلی که در جابه جا کردن بافت ها مورد استفاده قرار می گیرند، همچنین نمونه گیاهی که کشت می شود باید استریل باشد. عاری بودن هوا، سطح و کف پوش های آزمایشگاه از گرد و غبار حائز اهمیت است.
هودهای استریل
تمامی فعالیت ها در فضای هود لامینار ایرفلو (Laminar airflow) انجام می شوند. احتیاط ضروری این است که اجازه استفاده از هود استریل و مکان های مخصوص کشت بافت به سایر میکروبیولوژیست ها و پاتولوژیست ها داده نشود. اگر کار کشت بافت خودش احتیاج به غربالگری در برابر عوامل بیماریزا یا جداسازی توکسین ها و غیره داشته باشد، بایستی کارهای پاتولوژیکی را در مکان جداگانه ای انجام داد.
هودهای استریل مورد استفاده برای کشت بافت، باید دارای جریان هوای افقی از سمت عقب به سمت جلو باشند، در حالیکه هودهای دارای جریان هوای عمودی برای کار با پاتوژن ها و یا ترانسفورماسیون با میانجی گری آگروباکتریوم، ترجیح داده میشوند.
به طور کلی روش های مختلف استریلیزاسیون را می توان در سه قالب زیر توضیح داد:
- استریلیزاسیون محیط کشت ها، ظروف و ابزار آلات کوچک
- حفظ شرایط استریل
- استریلیزاسیون ریزنمونه
تهیه محیط های غذایی استریل، ظروف و ابزار آلات کوچک
رایج ترین روش برای استریل کردن محیط کشت ها و ابزار آلات، اتوکلاو کردن با استفاده از بخار و یا به صورت استریلیزاسیون خشک است.
۱- استریلیزاسیون توسط بخار
بیشتر محیط های غذایی را با استفاده از اتوکلاو استریل می کنند. شرایط استاندارد برای اتوکلاو کردن محیط کشت ها، دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار psi ۱۵ به مدت ۲۰ دقیقه می باشد. این شرایط برای لوله های آزمایش با سایر ظروفی که محتوی ۵۰-۲۰ میلی لیتر محیط کشت هستند، اعمال می شود. اتوکلاو دارای محدوده دمایی ۱۱۵ – ۱۳۵ درجه سانتیگراد می باشد. در یک استریلیزاسیون صحیح توسط اتوکلاو، فاکتورهای زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده ای که بایستی استریل شود، مورد توجه قرار گرفته و از راهنمای زیر بایستی پیروی شود:
- لوله های آزمایش و ظروف محتوی ۵۰-۲۰ میلی لیتر محیط کشت، به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار psi ۱۵
- ظروف محتوی ۵۰۰-۵۰ میلی لیتر محیط کشت، به مدت ۲۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار psi ۱۵
- ظروف محتوی ۵۰۰۰-۵۰۰ میلی لیتر محیط کشت، به مدت ۳۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار psi ۱۵
میزان نفوذ گرما در اتوکلاو کردن بسیار حائز اهمیت است. بنابراین حجم های زیاد را بایستی در مدت زمان بیشتری استریل کرد، چون در حجم های زیاد مدت زمان بیشتری طول می کشد تا گرما در تمام محیط کشت رسوخ کند.
استریلیزاسیون خشک
- شیشه آلات و ابزار آلات فلزی در گرمای خشک به مدت ۳ ساعت و دمای ۱۶۰- ۱۸۰ درجه سانتیگراد استریل می شوند. گرمای خشک در دمای ۱۶۰°C بمدت ۲ ساعت معادل گرمای مرطوب (بخار) در دمای ۱۲۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه است.
- وسایل خشک (اعم از ابزار آلات و شیشه آلات خالی) را می توان در ورقه های آلومینیومی پیچید و یا در ظروف فلزی درب دار قرار داد و سپس استریل نمود تا پس از سرد شدن به مدت زیادی در وضعیت استریل باقی بمانند.
اتوکلاوهای امروزی، هم به استریلیزاسیون خشک و هم به استریلیزاسیون مرطوب مجهز می باشند. اگر مواد خشک، یعنی ابزار آلات، شیشه آلات، پیپت ها، اجسام نوک تیز و غیره، بایستی استریل شوند، اتوکلاو را با سیکل خشک بکار می برند. برای استریل کردن مواد مایع (محیط کشت ها و آب)، استریلیزاسیون مرطوب (بخار) در اتوکلاو یا دیگ زودپز خانگی صورت می گیرد. البته وجود سوپاپ اطمینان، در این حالت الزامی است. از دیگ زودپز خانگی برای استریل کردن مقادیر کم محیط کشت، می توان استفاده کرد.
منبع: .کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم
دیدگاهتان را بنویسید