محیط کشت بافت گیاهی

بیشترین پیشرفت در توسعه محیط کشت برای پرورش سلول های گیاهی در شرایط این ویترو در دهه های ۱۹۶۰ و ۱۹۷۰ صورت گرفت. نیازهای اساسی سلول های گیاهی کشت شده، بسیار شبیه ترکیباتی است که توسط گیاهان در حالت طبیعی مصرف میشوند. با این وجود ترکیب مواد غذایی با توجه به سلول های بافت ها، اندام ها و پروتوپلاست های مختلف و همچنین با توجه به گونه های گیاهی خاص متغیر است. بنابراین در بحث محیط کشت ها، مشخص نمودن اینکه چه نوع کشتی اعم از کالوس، سلول، اندام یا پروتوپلاست بایستی مطالعه شود و اهداف و مقاصد از تحقیق کدامند، حائز اهمیت است.

ترکیب محیط کشت

ترکیب نمکی محیط کشت MS (تهیه شده توسط موراشیگ و اسکوگ در سال ۱۹۶۲) به طور گسترده ای در سیستم های مختلف کشت کاربرد دارد. ثابت شده است که در ساخت این محیط کشت و همچنین سایر محیط کشت ها، نه فقط حضور مواد مغذی ضروری، بلکه غلظت نسبی مواد غذایی غیر آلی مختلف نیز اهمیت زیادی دارد.

محیط کشت B5 اکنون به طور مؤثری در باززایی گیاهان مورد استفاده قرار می گیرد. محیط کشت B5 در دارا بودن مقادیر کمتری از نیترات به فرم آمونیوم از محیط MS متمایز می باشد. محیط غذایی N6 برای کشت دانه گرده غلات ساخته شد و با موفقیت در دیگر انواع کشت بافت های غلات به کار میرود. هر چه نسبت و غلظت مواد در محیط کشت به حد بهینه مورد نیاز برای رشد یا تمایز سلول ها و بافت ها نزدیکتر باشد، احتمال موفقیت کشت افزایش می یابد.

• مواد مغذی غیر آلی

مواد معدنی در زندگی یک گیاه بسیار مهم هستند. به عنوان مثال، کلسیم جزئی از دیواره سلولی است. نیتروژن جزء مهم اسیدهای آمینه، پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک و ویتامین ها است و منیزیوم جزئی از مولکول کلروفیل می باشد. همچنین آهن (Fe)، روی (Zn) و مولبیدن (Mo) در ساختار آنزیم های خاصی به کار می روند. علاوه بر اینها در کنار O،H ،C و N دوازده عنصر شناخته شده دیگر نیز برای رشد گیاه ضروری هستند.

انواع مختلفی از نمک ها، عناصر کم مصرف و پر مصرف مورد نیاز گیاه را به همان صورتی که مورد نیاز یک گیاه نرمال است، در دسترس قرار می دهند. نیتروژن (N)، پتاسیم (K)، فسفر (P)، کلسیم (Ca)، گوگرد (S) و منیزیوم (Mg) در مقادیر ماکرو و یا میلی مول مورد نیاز گیاه هستند. ریز مغذی های ضروری که در غلظت های میکرومولی مورد نیاز هستند، عبارتند از: آهن (Fe)، منگز (Mn)، بر (B)، مس (Cu)، روی (Zn)، ید (I)، مولیبدن (Mo) و کبالت (Co).

• منبع کربن و انرژی

بدون استثناء، منبع استاندارد کربن، ساکارز یا گلوکز است. فروکتوز نیز می تواند بکار رود، اما کارایی کمتری دارد. ساکارز در محیط غذایی سریعا به گلوکز و فروکتوز تبدیل می شود. اول گلوکز و به دنبال آن فروکتوز مصرف می شود. ساکارز معمولا در غلظت ۵-۲ درصد به کار می رود.

کربوهیدرات های دیگری که آزمایش شده اند عبارتند از لاکتوز، مالتوز، گالاکتوز و نشاسته. اما این ترکیبات نسبت به ساکارز و گلوکز در درجه بعدی قرار دارند. اکثر محیط کشت ها محتوی میواینوزیتول در غلظت ۱۰۰ میلی گرم بر مول هستند که رشد سلولی را بهبود می بخشد.

• ویتامین ها

گیاهان در حالت طبیعی، ویتامین هایی را که برای رشد و نمو نیاز دارند، خود سنتز می کنند، اما سلول های گیاهی در محیط کشت به ویتامین های مختلف نیاز دارند. به ویتامین B1 (تیامین) نیاز مطلق می باشد. همچنین با اضافه کردن اسید نیکوتینیک و ویتامین B6 ( پیریدوکسین) رشد نمونه بهبود می یابد. بعضی محیط ها محتوی اسید پانتوتنیک، بیوتین، اسید فولیک، پارا آمینو بنزوئیک اسید، کولین کلراید، ریبوفلاوین و اسید اسکوربیک هستند.

• تنظیم کننده های رشد

دو گروه اصلی از تنظیم کننده های رشد وجود دارد که در کشت بافت گیاهی از اهمیت ویژه ای برخوردارند. این دو گروه عبارتند از اکسین ها و اسیتوکینین ها، در حالیکه دیگر تنظیم کننده ها یعنی جیبرلین ها، اسید آبسیزیک، اتیلن و غیره اهمیت کمی دارند. هورمون اکسین ایندول استیک اسید (Indole acetic acid) (AA) و هورمون سیتوکینین ذآتین (Zeatin) نمونه هایی از هورمون های طبیعی هستند، در حالیکه بقیه تنظیم کننده های رشد مصنوعی هستند.

• مکمل های آلی نیتروژن آلی

سلول های کشت شده به طور طبیعی قادر به سنتز تمامی اسیدهای آمینه مورد نیاز خود هستند، اما حضور نیتروژن آلی به فرم اسیدهای آمینه همچون گلوتامین و آسپاراژین و به فرم نوکلئوتید همچون آدنین غالبا سودمند است. برای کشت سلول، اضافه نمودن ۰/۲ تا ۱ گرم بر لیتر هیدرولیزات کازئین (Casein hydrolysate) یا آمینواسیدهای بدون ویتامین، مفید است.

جشنواره پاییزه

جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع

همین الآن خرید کنید

در صورت اضافه نمودن اسیدهای آمینه بایستی احتیاط کرد، زیرا می توانند بازدارنده رشد باشند. اسیدهای آمینه ای که به محیط کشت اضافه می شوند و مقدار آنها بر حسب میلی گرم بر لیتر، عبارتند از: گلایسین، آسپارژین، تیروزین، آرژنین و سیستئین. بعضی اوقات سولفات آدنین نیز به مقدار ۱۲۰-۲ میلی گرم بر لیتر به منظور شکل زایی (Morphogenesis) به آگار اضافه می گردد.

• اسیدهای آلی

در صورتی که اسیدهای آلی تنها منبع کربن در محیط کشت باشند، سلول های گیاهی قادر نیستند از آنها استفاده کنند. اضافه کردن اسیدهای چرخه کربس، مانند سیترات، مالات، سوکسینات با افومارات، به سلول گیاهی اجازه می دهد تا در حضور آمونیوم به عنوان تنها منبع نیتروژن، رشد نمایند. سلول ها می توانند غلظت بیش از ۱۰ میلی مول اسید را تحمل کنند. ممکن است پیروات ارشد سلول های کشت شده با تراکم کم را افزایش دهد.

• مواد مرکب

در کشت بافت های گیاهی، انواع مختلفی از عصاره ها نظیر پروتئین هیدرولیزات، عصاره مخمر، عصاره مالت، شیره تار گیل، آب پرتقال و آب گوجه فرنگی آزمایش شده اند. اگر مواد مرکب در غلظت های بالاتر از حد مطلوب استفاده شوند، ممکن است بر رشد سلول ها اثر منفی بگذارند. توصیه می شود که در یک آزمایش مقدماتی، این مواد را در محدوده ای از ۰/۱ تا ۱ گرم بر لیتر استفاده نمایند تا تأثیرشان مشخص شود.

• ذغال فعال (Activated charcoal)

در غلظت های ۰/۲ تا ۳ درصد (۷/W) در مواقعی که ترکیبات شبه قتل مانع رشد کشت ها در این ویترو باشند، به کار می رود. این ماده می تواند رنگ دانه های قهوه ای و سیاه را جذب نموده و pH را ثابت نگه دارد. علاوه بر ذغال فعال، پلی وینیل پیرولیدین (۲۵۰ – ۱۰۰۰ میلی گرم بر لیتر)، اسید سیتریک و اسید اسکوربیک (هر کدام به مقدار ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر)، تیواوره و یا لسیتین نیز برای ممانعت از اکسیداسیون فنل ها استفاده می شوند. بعضی اوقات ترکیبی حاوی فتل به نام فلور گلوسینول، به منظور ممانعت از عمل آنزیم اکسیداز که مسئول تجزیه IAA است، به محیط کشت اضافه می شود.

• مواد منعقد کننده

آگار که از جلبک دریایی گرفته می شود، رایج ترین عامل منعقد کننده است. آگار یک پلی ساکارید با وزن مولکولی بالا است و توانایی ژله ای کردن محیط کشت ها را دارا می باشد. محلول آگار، ژلی را تشکیل می دهد که می تواند آب را نگهداشته و ترکیبات را جذب نماید. هر چقدر غلظت آگار بیشتر باشد، مولکول های آب با نیروی قویتری جذب می شوند.

محققین کشت بافت گیاهی، اغلب آگار دیفکوباکتر (Diffcobacto agar) را به غلظت ۰/۱ تا ۶ درصد وزنی به حجمی) بکار می برند، هر چند که سایر انواع آگار، مثل آگارز، فیتاگار و قلو آگار نیز رایج شده اند. اگر غلظت آگار خیلی زیاد باشد، ممکن است اثرات منفی بر کشت in vitro داشته باشد. در غلظت های زیاد، محیط کشت سفت شده و اجازه انتشار مواد به سمت بافت ها را نمی دهد.

• PH

PH بر جنبه های بسیار مهمی از ساختمان و فعالیت ماکرومولکول های بیولوژیکی تأثیر می گذارد. pH محیط کشت برای رشد مطلوب در این ویترو در محدوده ۶-۵ می باشد. pH بالاتر از ۷ و پایین تر از ۴/۵ رشد و نمو را متوقف می سازد. pH محیط کشت قبل از اتوکلاو کردن و بعد از آن متفاوت است و معمولا بعد از اتو کلاو کردن ۰/۳ تا ۰/۵ واحد کاهش می یابد.

اگر pH در طی روند کشت بافت گیاهی به نحو محسوسی افت نماید، محیط کشت به حالت مایع در می آید و یک محیط کشت تازه بایستی تهیه شود. بایستی در نظر داشت که pH بالاتر از ۶ موجب سفت شدن محیط کشت می شود و pH پایین تر از ۵ از منعقد شدن مطلوب آگار ممانعت می کند.

منبع : کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد

رسول رحیم پور