تاریخ :۹ فروردین ۱۴۰۳
مزایا و کاربرد نشانگرهای AFLP

مراحل تکنیک AFLP-PCR

  • مراحل تکنیک AFLP-PCR

    ۱- هضم DNA ژنومی

    برای هضم DNA ژنومی در مراحل تکنیک AFLP-PCR، از دو نوع آنزیم محدودگر مختلف استفاده می شود. یکی از این آنزیم ها شش بازبر (معمولا آنزیم EcoRI و یا Pst I و یا Hind III) که ردیف شش بازی را برش می دهند و دیگری آنزیم چهار بازبر معمولا آنزیم Mse I و یا Taq I که ردیف چهار بازی را شناسایی و برش می دهند، هستند. در برش DNA به کمک آنزیم های محدودگر باید مطمئن شویم که آنزیمها به درستی ژنوم را برش می دهند.

    تکنیک-AFLP-PCR

    تکنیک-AFLP-PCR

    نتایج تجربی نشان می دهند که اگر مقدار G-C بیش از ۶۵ درصد باشد، آنزیم Mse I  قادر به ایجاد تعداد قابل قبولی از قطعه های برشی نخواهد بود. بهترین نتایج با آنزیم Mse I وقتی حاصل می شود که مقدار G-C کمتر از ۵۰ درصد باشد. همچنین وقتی مقدار G-C ژنوم کم باشد، آنزیم EcoR I نیز قطعه های بیشتری را ایجاد خواهد کرد. کیفیت DNA ژنومی به منظور برش صحیح قطعه های DNA بسیار مهم است. اگر کیفیت DNA نامطلوب باشد، برش کامل DNA ژنومی امکان پذیر نخواهد بود.

    • در هر صورت با هضم DNA توسط این آنزیم ها سه نوع مختلف قطعه های برشی ایجاد می شود:
    1. قطعه هایی که در هر دو انتها توسط آنزیم ۶ باز بر هضم شده اند.
    2.  قطعه هایی که در هر دو انتها توسط آنزیم ۴ باز بر هضم شده اند.
    3. قطعه هایی که در یک انتها توسط آنزیم ۶ بازبر و در انتهای دیگر توسط آنزیم ۴ بازبر هضم شده اند.

    استفاده از آنزیم ۴ باز بر به این دلیل است که قطعه های هضم شده کوتاه با اندازه مناسب برای تکثیر PCR ایجاد شود. این قطعه ها دارای اندازه بهینه برای تفکیک بر روی ژل هستند. آنزیم ۶ بازبر برای کاهش دادن قطعه های تکثیر شونده به کار می رود. طراحی شرایط AFLP طوری است که تکثیر غالب مربوط به قطعه های برشی است که یک ردیف برش با آنزیم ۶ باز بر در یک انتها و یک ردیف برش با آنزیم ۴ باز بر در انتهای دیگر دارند. این مورد تعداد نوکلئوتیدهای انتخابی مورد نیاز برای تکثیر انتخابی قطعه های برشی را کاهش می دهد.

    مراحل تکنیک AFLP-PCR

    مراحل تکنیک AFLP-PCR

    ۲- اتصال سازگار سازهای دو رشته ای به انتهای قطعه های چسبنده

    پس از برش DNA را توسط آنزیم های محدودگر، سازگارسازهای الیگونوکلئوتیدی دو رشته ای (با ۱۲ تا ۲۰ جفت باز) به هر دو انتهای قطعه های برشی چسبنده اضافه می شود و جایگاه اتصال آغازگر برای تکثیر PCR مهیا می شود. سازگارسازهای مورد استفاده برای انتهای ایجاد شده توسط هر آنزیم محدودگر، به طور اختصاصی عمل می کنند. آغازگرهای AFLP نیز بنابر ردیف های هسته سازگارسازها و ردیف های جایگاه برش طراحی می شوند.

    گاهی علاوه بر اتصال سازگارساز به انتهای قطعه های برشی چسبنده، ممکن است قطعه های DNA که با هم سازگاری دارند به یکدیگر متصل شوند. در این حالت عدم تکرارپذیری باندها یا وضعیت لکه یا اسمیر را مشاهده خواهیم کرد. برای جلوگیری از اتصال قطعه های DNA به همدیگر، باید حتی در مرحله اتصال نیز آنزیم های محدودگر فعال باشند. همچنین توصیه می گردد که بی درنگ پس از اینکه آنزیم های محدودگر به طور کامل برش خود را انجام دادند، مرحله اتصال سازگارسازها انجام شود.

    ۳- تکثیر پیش از مرحله انتخاب – از مراحل تکنیک AFLP-PCR

    ردیفهای سازگارسازها و جایگاه های برشی به عنوان جایگاه های اتصال آغازگر برای تکثیر PCR پیش از مرحله انتخاب است. آغازگرهای پیش از مرحله انتخاب هر کدام یک نوکلئوتید انتخابی در انتهای ‘۳ برای آغازگرهای EcoRI و Mse I دارند و یا نوکلئوتید انتخابی برای آغازگر Pst I ندارند. محصولات اولیه PCR پیش از مرحله انتخاب قطعه هایی هستند که در یک انتها با آنزیم ۴ بازبر و در انتهای دیگر با آنزیم ۶ باز بر برش داده شده اند.

    AFLP-PCR

    AFLP-PCR

    همچنین دارای نوکلئوتید داخلی همساز در حالتی که یک نوکلئوتید انتخابی در نظر گرفته شده باشدT هستند. استفاده از یک نوکلئوتید انتخابی در انتهای ‘۳ آغازگر تعداد قطعه های برشی را ۱۶ مرتبه کاهش می دهد. در حقیقت در این مرحله الگوهای DNA مناسب برای مرحله تکثیر انتخابی فراهم می گردد. کاهش در تعداد قطعه های DNAای به همراه کاهش بیشتر در مرحله تکثیر انتخابی برای این است که از تعداد زیادی از قطعه های DNA ایجاد شده، فقط قطعه های ویژه ای تکثیر شوند.

    ۴ – تکثیر انتخابی

    در این مرحله از آغازگرهایی که فقط دو نوکلئوتید انتخابی (آغازگر | Pst) یا سه نوکلئوتید انتخابی (آغازگرهای Mse I و EcoRI) در انتهای ‘۳ دارند، برای تکثیر قطعه های الگو استفاده می شود. معمولا توصیه می شود در گونه هایی که ژنوم کوچک دارند مانند برنج از دو نوکلئوتید انتخابی. و در گونه هایی که ژنوم بزرگ دارند مانند ذرت و سویا از سه نوکلئوتید انتخابی استفاده شود. از نوکلئوتیدهای انتخابی در انتهای ‘۳ آغازگرها برای کاهش بیشتر قطعه های تکثیر شونده استفاده می گردد. زیرا تکثیر فقط برای قطعه هایی انجام می گیرد که ‘۳ نوکلئوتید مجاور جایگاه های برشی آنها دقیقا با نوکلئوتیدهای انتخابی آغازگر هماهنگ باشند.

    از آن جا که آغازگر Pst I دارای دو نوکلئوتید انتخابی در انتهای خود است و این دو نوکلئوتید انتخابی می توانند ترکیب هر یک از چهار نوع نوکلئوتید باشند، از این رو ۱۶ نوع مختلف آغازگر Pst I امکان پذیر است. همچنین از آن جا که آغازگرهای Mse I و EcoRI سه نوکلئوتید انتخابی در انتهای ‘۳ خود دارند، امکان طراحی ۶۴ آغازگر | Mse و EcoRI وجود خواهد داشت. پس در استفاده از جفت آغازگر Mse I و Pst I امکان بررسی ۱۰۲۴ ترکیب آغازگری و در استفاده از جفت آغازگر | Mse و EcoRI امکان بررسی ۴۰۹۶ ترکیب آغازگری برای تجزیه DNA الگو وجود خواهد داشت.

    جشنواره پاییزه
    جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع
    همین الآن خرید کنید

    ۵ – الکتروفورز فراوده های PCR در تکنیک AFLP-PCR

    به منظور آشکار شدن باندهای DNA در تکنیک AFLP-PCR، آغازگرهای EcoRI در انتهای ‘۵ خود با مواد پرتوزا یا مواد فلورسنت نشاندار می شوند. ولی قطعه هایی که دارای انتهای برش Mse I هستند، نشاندار نمی شوند. از این رو بعد از الکتروفورز ژل قابل رویت نیستند. البته بررسی AFLP بدون نشاندار کردن انتهای ‘۵ و با استفاده از رنگ آمیزی نیترات نقره نیز امکان پذیر است. قطعه های نشاندار شده با مواد پرتوزا در اتورادیوگرافی به صورت باند یا نوار قابل مشاهده اند.

    الکتروفورز فراوده های PCR در مراحل تکنیک AFLP-PCR

    الکتروفورز فراوده های PCR در مراحل تکنیک AFLP-PCR

    این مورد نیازمند جدا کردن ژل از دستگاه و قرار دادن آن در مقابل فیلم اشعه ایکس است. اگرچه در این روش می توان قطعه ها را مورد تجزیه بیشتر قرار داد. ولی این کار نسبتا گران است. روش دیگر نشاندار کردن، استفاده از آغازگرهای نشاندار فلورسنت و آشکار شدن نوارها به وسیله اسکن لیزری در دستگاه ردیف یاب خودکار است. نمونه بارز ردیف یاب های خودکار انواع مختلف ABI prismها می باشند که امروزه به فراوانی در ژنتیک انسانی و گیاهی در آزمایشگاه های معتبر دنیا استفاده می شوند.

    • مزیت استفاده از ردیف یاب خودکار

    مهم ترین مزیت استفاده از ردیف یاب خودکار این است که به کمک نرم افزارهای متصل به ردیف یاب و نشانگر داخلی هر چاهک می توان به طور خودکار قطعه ها را نمره دهی و تعیین اندازه نمود. از طرفی قدرت سیستم آشکار کننده لیزری طوری است که می تواند تا چهار نشاندار مختلف را به طور همزمان تشخیص دهد.

    این بدین مفهوم است که امکان تزریق چند نمونه مختلف در داخل هر چاهک وجود دارد. بدین طریق اطلاعات هر ژل افزایش می یابد. در نتیجه تعداد ژل ها و هزینه کاهش می یابد. عیب روش خودکار این است که قطعه ها، قابل نگهداری و استفاده بیشتر برای تجزیه های دیگر نیستند. از این رو برای همسانه سازی، نشاندار کردن با روش پرتوزا مناسب تر است.

    معایب تکنیک AFLP-PCR

    در حقیقت یکی از مشکلات AFLP برش ناقص DNA ژنومی و ایجاد قطعه های جزیی است. که در انگشت نگاری AFLP مشکل عدم تکرارپذیری الگوهای باندی را به دنبال خواهد داشت. به منظور پی بردن به کیفیت DNA مورد استفاده و همچنین پی بردن به وجود یا نبود برش ناقص، بررسی نمونه های مربوط به DNAهای مختلف از یک موجود به طور همزمان، پیشنهاد می شود. اگر الگوی بانددهی نمونه ها یکسان باشد، کیفیت DNA مناسب خواهد بود. در غیر این صورت باید در مرحله خالص سازی دستور کار استخراج DNA تجدید نظر شود.

    معایب تکنیک AFLP-PCR

    معایب تکنیک AFLP-PCR

    منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵

    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *