تکنیک Touchdown PCR
تکنیک Touchdown PCR برای افزایش ویژگی واکنش های PCR است. Touchdown PCR از یک برنامه چرخه ای استفاده می کند که در آن دمای اتصال به تدریج کاهش می یابد (به عنوان مثال ۱ تا ۲ درجه سانتیگراد/ در هر چرخه دوم). دمای اولیه اتصال باید چندین درجه بالاتر از Tm برآورد شده آغازگرها باشد. سپس دمای اتصال به تدریج کاهش می یابد تا زمانیکه به دمای اتصال محاسبه شده آغازگرها برسد. در نهایت تکثیر با استفاده از این دمای اتصال ادامه می یابد.
دمای مطلوب اتصال نیاز اساسی در یک واکنش PCR است. این به طور معمول بر اساس دمای ذوب (Tm) جفت آغازگر-الگو تعیین می شود. اما، دمای ذوب آغازگر به طور متفاوتی تحت تأثیر اجزای واکنش حتی غلظت آغازگر و الگو قرار می گیرد. بنابراین هر مقدار دمای ذوب محاسبه شده آغازگر فقط یک تقریب است. بنابراین، یافتن دمای مناسب اتصال برای یک ترکیب آغازگر/ الگو، اغلب دشوار است. دمای پایین اتصال می تواند منجر به تشکیل پرایمر-دایمر و محصولات غیر اختصاصی شود. درحالیکه دمای بسیار بالا به دلیل اتصال ضعیف آغازگر باعث کاهش عملکرد می شود.
هدف از انجام تکنیک Touchdown PCR
Touchdown PCR به منظور افزایش اختصاصیت PCR بکار می‌رود. از جمله راه‌های رسیدن به این هدف، تغییر دادن پارامترهای مربوط به هر چرخه است. در Touchdown PCR، این تغییر در مرحله اتصال چرخه ایجاد می‌شود. به این نحو که در اولین چرخه‌ها، دمای اتصال چند درجه بالاتر از حداکثر نقطه ذوب پرایمرها است و سپس رفته‌رفته کاهش می‌یابد تا زمانیکه به دمای بهینه اتصال پرایمرها که برابر یا کمی پایین‌تر از حداقل نقطه ذوب پرایمرها است، “touchdown” کند. این تکنیک برای نخستین بار در سال ۱۹۹۱ ارائه شد و قابلیت اجرا روی دستگاه‌های PCR را دارا است.
چرخه Touchdown PCR دو فاز دارد
چرخه حرارتی دارای دو فاز جداگانه است. فاز اول، فاز Touchdown PCR نام دارد و با دمای اتصالی بالاتر از Tm پرایمرهای مورد استفاده شروع و در طی چرخه‌های متوالی کاهش پیدا می‌کند. تا زمانی که به دمای Touchdown برسیم. فاز دوم هم شامل فرایند تکثیر عادی در این دما است.
فاز اول
در فاز اول برنامه نویسی لمسی از Tm استفاده می شود که تقریباً ۱۰ درجه سانتیگراد بالاتر از Tm محاسبه شده است. دما تا زمان رسیدن به محدوده Tm محاسبه شده در هر چرخه متوالی ۱ درجه سانتیگراد کاهش می یابد. این کار در کل برای ۱۰-۱۵ چرخه انجام می شود.
فاز دوم
با استفاده از دمای اتصال نهایی رسیده در مرحله touchdown، تکثیر PCR عمومی را تا ۲۰-۲۵ چرخه دنبال می کند.
نکته: در صورت مشاهده محصولات غیر اختصاصی یا عملکرد پایین، چرخه ها و افت دما در مرحله لمس را می توان از ۱ الی ۳ سیکل در هر ۱ الی ۳ درجه سانتیگراد کاهش دما، تنظیم کرد.
نکات کلی برای انجام مراحل تکنیک Touchdown PCR
۱- سرد نگه داشتن همه واکنش ها تا زمان شروع چرخه حرارتی برای جلوگیری از پرایمینگ غیر اختصاصی حتی با TD-PCR بسیار مهم است. از آنجا که هدف اصلی TD-PCR از بین بردن فعل و انفعالات غیر اختصاصی در طی چرخه های اولیه است، استفاده از تنظیمات شروع گرم بسیار مهم است.
۲- TD-PCR می تواند مشکلات مربوط به واکنش های مونوپلکس را بهتر از واکنش های مالتی پلکس برطرف کند.
۳- تعداد کل چرخه PCR، از جمله مرحله touchdown باید پایین باشد (زیر ۳۵). چرخه های زیاد منجر به ظهور نوارهای غیر اختصاصی در ژل می شود.
۴- یک چرخه دناتوراسیون ۱ دقیقه اضافی در ۹۶ درجه سانتیگراد یا ۹۷ درجه سانتیگراد ممکن است برای الگوهای دشوار بسیار مفید باشد.
۵- Touchdown PCR راهی ساده برای تقویت واکنش‌های PCR است. با این حال ممکن است پژوهشگران به مواردی برخورد کنند که هیچ گونه محصولی تولید نشود و یا اینکه محصولات چندگانه با اندازه‌های نادرست تولید گردند. در چنین شرایطی استفاده از hot start PCR همراه با Touchdown PCR می‌تواند بسیار مفید واقع شود.
۶- این تکنیک جلوی اتصال نادرست پرایمر را با حذف یکی از مواد اولیه اصلی واکنش پیش از مرحله دناتوراسیون و یا با افزودن یک مهارکننده قابل برگشت پلیمراز می‌گیرد. hot start همچنین اختصاصیت واکنش را با جلوگیری از تشکیل دایمرهای پرایمر در چرخه‌های آغازین، افزایش داده و تکثیر توالی‌های دشوار را آسان‌تر می‌کند.
منبع: www.bitesizebio.com
دیدگاهتان را بنویسید