واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون برابر در کمتر از نیم روز امکان پذیر می کند. اما این فرایند هنگامی امکان پذیر است که دست کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA مورد نظر معلوم باشد. در این تکنیک که تقلیدی از فرآیند همانند سازی DNA در طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده در انتهای قطعه مورد نظر DNA هستند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می گیرند.

در نهایت واکنش آنزیمی همانندسازی DNA را در درون لوله آزمایش امکان پذیر شود. این همانندسازی فرآیندی آنزیمی است. و توسط انواع مختلفی از آنزیم های پلیمراز صورت می گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم ها به صورت تجاری در دسترس اند.

تاریخچه

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در سال ۱۹۸۳ توسط کری مولیس ابداع گردید. و سبب انقلاب عظیمی در زیست‌شناسی مولکولی شد. وی به دلیل همین اختراع در سال ۱۹۹۳ موفق به دریافت جایزه نوبل در رشته بیوشیمی شد. در سال ۱۹۷۹ با شرکت ستوس که در زمینه ساختن رشته‌های DNA کار می‌کرد، شروع به همکاری نمود. روش PCR نخستین بار توسط محققان ستوس برای تکثیر DNA بتا گلوبین انسانی و تشخیص بیماری کم خونی داسی شکل مورد استفاده قرار گرفت. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در سال ۱۹۸۵ معرفی شد و در مدتی کمتر از ۱۰ سال انقلابی را در زمینه زیست‌شناسی مولکولی ایجاد کرد. به طوری که امروزه در تمامی پژوهش‌های مرتبط با زیست‌شناسی اعم از:

پزشکی،
کشاورزی،
گیاه شناسی،
جانورشناسی و غیره به نحوی از این روش استفاده می شود.

اهمیت و ضرورت واکنش PCR

این واکنش بسیار اختصاصی است. و قادر است عمل تکثیر را از مقادیر فوق العاده کم DNA الگو آغاز کند.
به کمک این روش می‌توان نزدیک به ۵ کیلوباز از ژنوم را بدون هیچ مشکلی تکثیر نمود.
با پیشرفت‌های به عمل آمده و کشف آنزیم‌های پلیمراز جدیدتر و همچنین با انجام برخی تغییرات و با استفاده از کیت‌های مخصوص PCR، می‌توان تا ۴۰ کیلو باز را نیز تکثیر نمود.
الیگونوکلئوتیدها یا آغازگرها پس از اتصال به رشته الگو برای توسعه رشته‌های DNA جدید در دو جهت مخالف عمل می‌کنند. با انتخاب صحیح جایگاه‌های اتصال آغازگر و شرایط مناسب واکنش، رشته جدید DNA ساخته خواهد.

نشانگرهای مورد استفاده در واکنش زنجیره ای پلیمراز

نشانگرهای مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز شامل نشانگرهایی اند که با بهره گیری از واکنش زنجیره ای پلیمراز در آنها، نیاز به کاوشگر و در نتیجه دورگ گیری حذف می شود. این گروه از نشانگرها از توالى الیگو نوکلئوتیدی به عنوان آغازگر برای تکثیر قطعه خاصی از DNA استفاده می کنند. روش های مختلف در این گروه، در طول و توالی آغازگرها، سختی شرایط PCR و روش های جداسازی و آشکار کردن قطعات با همدیگر فرق دارند. همچنین انگشت نگاری ایجاد شده می تواند بر پایه DNA یا RNA باشد.

واکنش-زنجیره-پلیمراز

مراحل واکنش زنجیره ای پلیمراز

واکنش زنجیره ای پلیمراز دارای سه مرحله است:

۱- در مرحله نخست یا مرحله واسرشته سازی، DNA الگو در دمای زیاد (۹۴-۹۳ درجه سانتیگراد) واسرشته شده و رشته‌های مکمل از همدیگر جدا می‌شوند.

۲- در مرحله دوم یا مرحله اتصال آغازگر، در دمای کمتر (۶۵-۳۶ درجه سانتیگراد) نسبت به مرحله اول صورت می‌گیرد. در نهایت شرایط اتصال آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی به ناحیه مکمل بر روی DNA الگو فراهم می‌شود.

جشنواره پاییزه

جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع

همین الآن خرید کنید

۳- در مرحله سوم یا مرحله توسعه آغازگر، که معمولا در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد، ساخته شدن DNA جدید امکان‌پذیر می‌شود. از طریق افزوده شدن نوکلئوتیدها به انتهای آغازگر بر مبنای الگوگیری از رشته DNA موجود و پلیمریزه شدن نوکلئوتیدها. آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی در حضور ۴ دی اکسی نوکلئوتید dGTP ،dTTP ،dCTP ،ATP و شرایط بافری خاص توسعه می‌یابند و در نتیجه ناحیه DNA الگو بین دو آغازگر تکثیر می‌شود.