کشت سوسپانسیون سلولی

اولین بار توسط هابرلانت (Haberlant) در سال ۱۹۰۲ تلاش هایی در زمینه جداسازی و کشت سلول های منفرد از برگ گیاهان گلدار صورت گرفت. اگرچه وی موفق به تکثیر سلول های انفرادی نشد، اما کار وی نقطه شروعی بود تا سایر محققین به پیگیری تحقیقات در این زمینه پردازند. امروزه پیشرفت قابل ملاحظه ای در این زمینه صورت گرفته است. به طوریکه نه تنها امکان کشت سلول های انفرادی وجود دارد، بلکه می توان یک سلول را تحریک به تقسیم نموده و گیاه کاملی از آن تولید کرد.

کشت سوسپانسیون سلولی، شامل توده های سلولی پراکنده و در حال رشد در محیط کشت مایع و جنبان است. این کشت ها معمولا با انتقال قطعاتی از کالوس ترد و تمایز نیافته به یک محیط کشت مایع که بطور یکنواخت و مداوم تکان داده می شود، شروع می شوند.

مراحل تهیه کشت سوسپانسیون سلولی:

کشت های سوسپانسیونی از جوانه های استریل، جنین یا برگ های متورم نیز به روش مکانیکی تهیه شده اند، بدین صورت که:

۱- برگ یا بافت های دیگر را به آرامی آسیاب نموده و یا بافت های نرم را با استفاده از مخلوط کن شیشه ای دستی خرد و له مینمایند.

۲- این مخلوط همگن که محتوی سلول های زنده سالم، سلول های مرده، و ضایعات سلولی است، با استفاده از فیلتر و سانتریفیوژ صاف شده و سپس به محیط کشت مایع جنبان انتقال داده می شود.

۳- برای جدا کردن سلول های منفرد، از آنزیم پکتیناز که لایه پکتین را هضم می نماید، نیز استفاده شده است. با این حال، برای استفاده در تحقیقات پایه ای و کاربردی، سلول ها از بافت های کشت شده تهیه می گردند.

۴- قطعات تازه برش یافته ای از اندام های گیاهی را بر روی یک محیط غذایی جامد حاوی هورمون های مناسب کشت می دهند.

۵- پس از تولید بافت کالوس، به منظور تولید مقدار قابل ملاحظه ای از این بافت، آن را از ریزنمونه والد جدا نموده و به محیط کشت جدیدی انتقال می دهند. این کالوس به محیط کشت مایع انتقال یافته و تکان داده می شود تا سوسپانسیون سلولی خوبی ایجاد شود.

عوامل موثر در موفقیت کشت سوسپانسیون سلولی

موفقیت در ایجاد کشت سوسپانسیون به کالوس اولیه بستگی دارد. استفاده از ریزنمونه های متنوع و محیط کشت های مختلفی نظیر MS B5 ،LS و بلایدز (Blay des)، برای القاء کالوس موفقیت آمیز بوده است. انواع متفاوتی از این محیط های غذایی همراه با تغییرات مناسب به طور گسترده استفاده می شوند.

جشنواره پاییزه

جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع

همین الآن خرید کنید

ویتامین ها، اینوزیتول، ساکارز و مواد تنظیم کننده رشد به ویژه اکسین (توفوردی به مقدار  ۱ تا ۵ میکرومول) نیز به این محیط کشت ها اضافه می شوند. سرعت رشد و تردی کالوس تولید شده بسته به نوع ریزنمونه می تواند متفاوت باشد. محیط کشت مورد استفاده برای کشت سوسپانسیون بایستی به نحوی باشد که رشد خوب کالوس را تضمین نماید.

کاربردهای کشت های سوسپانسیونی

1. سوسپانسیون سلولی جنین زا، امکان تکثیر گیاهان مشابه را به طور گسترده فراهم می کند.
2. جنین ها اندام های طبیعی بقاء گیاه هستند که بسیاری از آنها به صورت نهفته در می آیند و به خاطر نهفتگی ذاتی، جنین های سوماتیکی حاصل از سوسپانسیون های سلولی برای ذخیره طولانی مدت در بانک های ژرم پلاسم بسیار مفیدند.
3. کشت های سوسپانسیونی جنین زا در مطالعات نظری و تحقیقات عملی از اهمیت ویژه ای برخوردارند. اعمال روش های گزینش در کشت های جنین زایی، به ایجاد تنوع در قبال تنش های زنده و غیر زنده می انجامد.
4. کشت سوسپانسیون سلولی جنین زا و جمعیت جنین های سوماتیکی، منبعی برای تولید مواد شیمیایی است. جنین های سوماتیکی کرفس ترکیبات معطری مشابه گیاه بالغ تولید می نمایند که این ترکیبات در کشت های کالوس کرفس وجود ندارند. جنین های سوماتیکی کاکائو نیز مانند جنین های حاصل از زایگوت یکسری مواد چرب شبیه روغن کاکائو تولید می نمایند.

شیکرهای افقی دوار

شیکرهای افقی دوار برای شروع، نگهداری و تکثیر کشت های سوسپانسیونی سلول های گیاهی استفاده گسترده ای دارند. این شیکرها بایستی از یک کنترل سرعت قابل تنظیم در محدوده ۳۰ – ۱۵۰ دور در دقیقه برخوردار بوده و در یک محدوده ۸-۴ سانتی متری به صورت اربیتالی حرکت نمایند.

تکان دادن محیط کشت با استفاده از شیکر با دو هدف صورت می گیرد:

۱- اولا، این اعمل فشار ملایمی بر توده های سلولی وارد می آورد و آنها را به توده های کوچکتر و سلول های انفرادی می شکند.

۲- ثانیا، پراکنش یکنواختی از سلول های منفرد و توده های سلولی در محیط کشت ایجاد می شود. همچنین در اثر این حرکت، تبادل گازی مطلوبی بین محیط کشت و هوا برقرار می شود. شیکر را بایستی در اتاقی با قابلیت تنظیم دما قرار داد.

• از ظروف ارلن مایر دهانه گشاد برای کشت های سوسپانسیونی استفاده گسترده ای می شود:

حجم کشت بایستی مطابق با حجم ظرف کشت باشد. به عنوان مثال در ارلن مایر ۱۰۰ میلی لیتری ۲۰ میلی لیتر، و در ظرف ۲۵۰ میلی لیتری ۷۰ میلی لیتر محیط کشت ریخته می شود. معمولا دهانه ارلن ها را با ورقه آلومینیومی می پوشانند. درپوش ارلن بایستی محیط استریل درون ارلن را حفظ نماید، برای تبادلات گازی نفوذپذیر باشد و تبخیر را کاهش دهد. می توان از توده های پنبه ای برای بستن دهانه ظروف در اتوکلاو استفاده کرد، اما برای بستن دهانه ظرف کشت نبایستی از آنها استفاده نمود، زیرا توده های پنبه ای خود از عوامل معمول آلودگی در ظروفی هستند که به مدت چند هفته بر روی شیکر قرار داده می شوند.

تهیه واکشت را به سه روش می توان انجام داد:

1. اجازه داده می شود کشت ها اندکی رسوب نمایند و سپس مقداری از موادی را که هنوز به صورت سوسپانسیون هستند با استفاده از پیپت برداشته و به محیط کشت جدید انتقال می دهند.
2. در حین عمل انتقال، از پیپت هایی که تدریج قطر دهانه آنها کاهش داده می شود، به طور متوالی استفاده می گردد.
3. قبل از واکشت، سوسپانسیون مزبور از صافی عبور داده می شود و عمل واکشت از محلول رقیق شده صورت می گیرد. با افزودن آنزیم هایی نظیر سلولاز و پکتیناز به محیط می توان میانگین اندازه توده سلولی را کاهش داد.

منبع:  کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.

رسول رحیم پور