عوامل موثر در تکرارپذیری نشانگر RAPD: روش های مولکولی غیر تکرارپذیر محدودیت های زیادی دارند که عمده ترین آنها عدم امکان مقایسه نتایج، بین آزمایشگاه های مختلف است. همچنین در صورت کم بودن تکرارپذیری بانک اطلاعات برای شناسایی وجود نخواهد داشت. در این حالت اعتبار داده های بدست آمده زیر سؤال خواهد بود. به دلیل تصادفی بودن و اختصاصیت کم واکنش RAPD، این روش از تکرارپذیری و قابلیت اعتماد کمی برخوردار است.
عوامل موثر در تکرارپذیری نشانگر RAPD
عوامل موثر در تکرارپذیری RAPD به طور عمده تحت تأثیر عوامل زیر است:
۱- کیفیت و کمیت DNA
DNA با کیفیت ضعیف اعتبار داده های RAPD را تحت تأثیر قرار داده و تکرار پذیری آنها را کاهش می دهد. همچنین شکستگی DNA الگو نیز می تواند مانع تکثیر برخی از قطعه های بزرگ شود و در نتیجه تکرارپذیری باندها را تحت تأثیر قرار می دهد. اگر غلظت DNA ژنومی از یک مقدار معین کمتر باشد، رپید تکرارپذیر نخواهد بود. همچنین اگر مقدار DNA از حد معمول بیشتر باشد، وضوح کم باندهی و وضعیت اسمیر را به همراه خواهد داشت. معمولا بین ۱۰ تا ۳۰ نانوگرم از DNA در ۲۵ میکرولیتر واکنش توصیه می شود. ولی بهترین روش، استفاده از غلظت های مختلف به صورت تجربی، به منظور بدست آوردن بالاترین مقدار تکرارپذیری است.
معمولا DNA هایی که خیلی سریع تهیه می شوند، مقدار زیادی از RNA (شاید بیش از ۱۰ برابر DNA) را به همراه دارند و این موجب می شود که دستگاه اسپکتوفتومتری نتواند به خوبی مقدار غلظت DNA را مشخص کند. در این مورد استفاده از آنزیم RNAase به منظور حذف RNA ضروری است.
۲- آلودگی بیولوژیک
در تمامی روش های مختلف PCR باید دقت شود تا از آلودگی های بین نمونه ای جلوگیری شود و سعی شود تا تمام اجزای PCR دارای خلوص زیادی باشند. این مورد بویژه برای روش PCR آغاز کر اختیاری (AP-PCR) اهمیت بیشتری دارد. در حقیقت به صورت بالقوه تمامی آلوده کننده های DNA می توانند به کمک آغازگرهای اختیاری، فراورده های PCR و در نتیجه باند ایجاد کنند.
بنابراین استفاده از کنترل منفی که شامل اتمامی اجزای واکنش به جز DNA الگو است، برای پی بردن به وجود آلودگی الزامی است. البته باید توجه داشت که حتی در استفاده از آب مقطر دوبار استریل شده نیز ممکن است بعد از ۳۵ چرخه PCR باندهای غیراختصاصی دیده شود. تولید کنندگان DNA پلیمراز Taq معتقدند که احتمالا به دلیل باقی ماندن قسمتی از DNA میزبان در جریان تهیه پلیمراز Taq این مورد اتفاق می افتد.
۳- غلظت آغازگر یکی از عوامل موثر در تکرارپذیری نشانگر RAPD
غلظت آغازگر مورد استفاده نباید از حد معمول کمتر باشد. آغازگرهایی که به صورت محلول منجمد نگهداری می شوند با ذوب و منجمد کردن مجدد از بین می روند. از این رو هر از چند گاهی باید از نظر کارآمد بودن آزمایش شوند. نکته مهم دیگر آن است که آغازگرها پیش از استفاده باید به طور کامل ذوب و تکان داده شوند.
۴- غلظت منیزیم
غلظت کم یون منیزیم به کاهش بانددهی رپید منجر می شود. گاهی غلظت منیزیم در واکنش کم نیست، ولی وجود مقدار زیاد EDTA (برای مثال در بافر TE)، باعث واکنش آن با منیزیم و تشکیل کمپلکس می گردد و در نتیجه سبب کاهش غلظت منیزیم در دسترس می شود. از این رو در صورت افزایش مقدار EDTA باید غلظت منیزیم را نیز افزایش داد. مقدار منیزیم مورد نیاز از راه تجربی با به کارگیری غلظت های متفاوتی از منیزیم از ۴-۱ میلی مولار قابل دستیابی خواهد بود.
۵- تکرارپذیری نیمرخ های دستگاه PCR
رپید به نیمرخ حرارتی پی.سی.ار حساس است. دستگاه های ترموسایکلر مختلف هر چند دارای پارامترهای یکسانی باشند، تفاوت های جزیی دارند. چنانکه حتی دستگاه هایی از یک مدل و یک کارخانه نیز ممکن است در این مورد متفاوت باشند. همچنین با افزایش عمر دستگاه، نیمرخ حرارتی آن نیز ممکن است تغییر کند. البته نیمرخ های رپید به دست آمده از ماشین های مختلف، درصورتی که حداقل نیمرخ حرارتی آنها یکسان باشد، تکرارپذیر خواهند بود.
۶- زمان واسرشته سازی
زمان واسرشته سازی به اندازه ژنوم مورد بررسی بستگی دارد. ولی در هر صورت کمترین زمان واسرشته سازی (۵ ثانیه، ۹۴ درجه سانتیگراد) پیشنهاد شده است. در صورت کم بودن زمان واسرشته سازی، دورشته دی.ان.ای به طور کامل از همدیگر جدا نخواهد شد و در نتیجه DNA الگوی کمتری در اختیار آنزیم Taq قرار خواهد گرفت.
۷- درجه حرارت اتصال
معمولا دمای اتصال ۳۶-۳۰ درجه سانتیگراد در نظر گرفته می شود. ولی با توجه به بهینه کردن شرایط PCR می توان آن را تا ۴۰ درجه نیز تنظیم کرد. شکل ۶-۵ انتخاب بهترین آغازگر را از بین چهار آغازگر براساس درجه حرارت مرحله اتصال نشان می دهد. همچنانکه از شکل مشخص است، بانددهی آغازگر ۲ در دامنه ای از ۳۲ تا ۴۲ درجه سانتیگراد تکرارپذیر است، درحالی که آغازگری های دیگر نسبت به درجه حرارت حساسیت نشان می دهند.
۸- مدت زمان طویل شدن آغازگر (ساخته شدن DNA)
مطالعات انجام شده توسط یو و پالز (۱۹۹۴) روی ژنوم گیاهان نشان می دهد که با افزایش زمان طویل شدن از ۵ ثانیه به ۱ دقیقه قطعه های بزرگ تری قابل مشاهده بوده اند. به طوری که در مدت زمان طویل شدن ۵ ثانیه، قطعه های کمتر از یک کیلو جفت باز و در مدت زمان ۶۰ ثانیه، قطعه های بیشتر از سه کیلو جفت باز بدست آمده است.
۹- دقت در پیپت نمودن
برداشتن محلول های با حجم کمتر از سه میکرولیتر سبب ایجاد خطاهایی در آزمایش تکنیک RAPD می شوند. همچنین بسیاری از پیپت های چند کاناله با حجم کمتر از ۵ میکرولیتر از دقت کافی برخوردار نیستند. از این رو رقیق کردن قسمتی از محلول ذخیره اصلی به منظور پیپت نمودن بیش از ۵ میکرولیتر توصیه می شود.
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران
دیدگاهتان را بنویسید