جداسازی پروتوپلاست ها به روش آنزیمی

آزادسازی پروتوپلاست ها، بستگی شدیدی به نوع و ترکیب آنزیم های مورد استفاده در هضم دیواره سلولی دارد. سه ترکیب عمده دیواره سلولی عبارتند از:

• سلولز

• همی سلولز و

• پکتین

سلولز و همی سلولز :

سازنده ساختمان اولیه و ثانویه دیواره سلولی می باشند و پکتین یکی از مواد سازنده تیغه میانی (Middle lamella) است که سلول های مجاور را به یکدیگر متصل می نماید.

آنزیم پکتیناز (Pectinase):

تیغه میانی سلول های مجاور را هضم می نماید، در حالی که آنزیم های سلولاز (Cellulase) و همی سلولاز (Hemicellulase) به ترتیب برای هضم ترکیبات سلولزی و همی سلولزی موجود در دیواره سلولی به کار می روند.

پر مصرف ترین آنزیم پکتیناز، ماسروزایم یا ماسراز (Macerozyme or Macerase) است که از قارچ های رایزوپوس (R/EPRIS) گرفته شده است. آنزیم دیگری به نام دریلار (Drisease)، هم فعالیت سلولازی و هم پکتینازی دارد که به تنهایی برای جداسازی پروتوپلاست از کشت های سلولی با موفقیت به کار رفته است.

آنزیم سلولاز R10:

آنزیم سلولاز R10 که عموما برای هضم دیواره به کار می رود از قارچ های Trichodernia reeset و T. viridle خالص سازی شده است. در بعضی موارد برای بافت های رکالسیترانت افزودن آنزیم همی سلولاز ضروری است، که در چنین مواقعی از ۱۵۰
Rhozyme HBاستفاده می شود.

علاوه بر اینها، آنزیم های دیگری از جمله هلیکاز (Helicase)، کلوناز (Colonnaise)، سلولیزین (Cellulysin)، گلوزولاز (Glusulase)، زایمولیاز (Zymolyase)، مسیلاز (Meicelase) و پکتولیاز (Pectolyase) نیز وجود دارند که برای تیمار بافت هایی که پروتوپلاست های آنها به راحتی آزاد نمی شوند، مورد استفاده قرار می گیرند.

تیمار سلول های آلورون جو با سلولاز، منتج به پروتوپلاست هایی با بخش هایی از دیواره سلولی مقاوم به سلولاز می شود. این سلولها که اسفروپلاست (Sphaeroplast) نامیده می شوند، با گلوزولاز تیمار می شوند تا باقیمانده دیواره سلولی آنها هضم شود.

جشنواره پاییزه

جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع

همین الآن خرید کنید

شرایط دمایی و میزان pH مورد نیاز هضم آنزیمی جهت جداسازی پروتوپلاست ها:

فعالیت آنزیم به pH محیط بستگی دارد و pH بهینه آنزیم توسط شرکت سازنده آن مشخص می شود. با این حال pH محلول آنزیمی در محدوده ۶-۴/۷ تنظیم می گردد. عموما درجه حرارت ۲۵ – ۳۰°C برای جداسازی پروتوپلاست ها کافی است. دوره تیمار با آنزیم بایستی به طور تجربی مشخص شود. با این وجود، زمان تیمار ممکن است یک دوره کوتاه مدت ۳۰ دقیقه ای تا ایک دوره بلند مدت ۲۰ ساعتی باشد.

جداسازی پروتوپلاست ها به روش آنزیمی می تواند به دو صورت انجام شود:

١- روش دو مرحله ای با متوالی:

در ابتدا بافت مورد نظر با یک ماسروزایم یا آنزیم پکتیناز تیمار می شود که با هضم تیغه میانی سلول ها، آنها را از هم جدا مینماید. سپس سلول های آزاد شده را تحت تیمار سلولاز قرار می دهند تا پروتوپلاست ها آزاد شوند. به طور کلی در این روش سلول ها در مدت زمان کوتاهی تحت اثر دو آنزیم مختلف قرار می گیرند

۲- روش یک مرحله ای یا همزمان:

در این روش بافت گیاهی را در یک مرحله در معرض مخلوطی از هر دو آنزیم ماسروزایم و سلولاز قرار می دهند. عموما به دلیل راحتی کار، از روش یک مرحله ای برای جداسازی پروتوپلاست ها استفاده می شود. از آنجا که در حین تیمار آنزیمی، دیواره سلولی که به عنوان یک حصار مکانیکی حمایت کننده بروتوپلاست است، شکسته می شود، پس بایستی پروتوپلاست های تهیه شده به نحوی تثبیت شوند. بدین منظور یک ماده تعدیل کننده فشار اسمزی (Ostnoticum) به مخلوط واکنش افزوده می شود تا از ترکیدن پروتوپلاست ها ممانعت به عمل آورد.

منبع:  کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.

رسول رحیم پور