پروتوپلاست های هر دو گونه دلخواه می توانند با یکدیگر امتزاج یابند. با این حال، محدودیت هایی برای استفاده گسترده از هیبریداسیون سوماتیکی در گیاهان عالی وجود دارد. از جمله این محدودیت ها می توان به آنیوپلوئیدی، موانع گونه ای برای دورگ گیری و ناتوانی پروتوپلاست ها در باززایی گیاه، اشاره نمود.
گذشته از این محدودیت ها، هیبریدهایی که تولید می شوند، بایستی به عنوان محصولات حاصل از امتزاج سوماتیکی دو پروتوپلاست مختلف، مورد تأیید قرار گیرند. عبور موفق از یک سیستم گزینشی، اولین مدرک موثق برای ماهیت هیبرید سوماتیکی مواد گیاهی انتخاب شده می باشد.
مدارک بعدی باید بر مبنای صفاتی ارائه شوند که در فرآیند گزینش مدنظر قرار نگرفته اند. اثبات هیبرید بودن، مستلزم اثبات سهیم شدن ژنتیکی هر دو والد مورد نظر در امتزاج است و فرد هیبرید بایستی فقط در میان یو پلوئیدها جستجو شود نه در میان آنیوپلوئیدها.
۱- مورفولوژی:
وقتی که باززایی گیاهی از امتزاج پروتوپلاست ها صورت پذیرفت، برای افراد هیبرید در بین گیاهان انتخاب شده، از طیف وسیعی از صفات مورفولوژیکی می توان پیاده کرد. در اکثر موارد خصوصیات مورفولوژیکی هیبریدهای سوماتیکی با جنسی در حد رابط خصوصیات والدین است. هم خصوصیات رویشی و هم خصوصیات گل، از قبیل شکل برگ، سطح برگ، اندازه دمبرگ، شکل ریشه، تراکم و طول کرک های سطح برگ، شکل ریشه، اندازه و ساختار گل، شکل جام گل، شدت رنگ گل و شکل کپسول بذر مورد توجه قرار می گیرند.
اساس ژنتیکی اکثر این صفات ظاهری هنوز مشخص نشده است، اما بروز وضعیت حد اواسط در افراد هیبرید، بیانگر کنترل این صفات با ژن های چندگانه (Multiple genes) می باشد. در مورد بعضی صفات در هیبریدهای سوماتیکی فنوتیپ حد واسط مشاهده نمی شود. اینگونه اصفات توسط یک ژن غالب کنترل می شوند و فقط در یکی از والدین وجود دارند که در هیبرید سوماتیکی نیز بیان می شوند.
این صفات شامل:
- رنگ آنتوسیانین در ساقه
- رنگ گل
- گره هی هتروکروماتینی در سلول های اینترفازی
- و اندازه برگ می باشند.
قابلیت حیات دانه گرده در افراد هیبرید به طور کلی کاهش می یابد. در صورت امکان، برای تایید یک هیبرید، اطلاعات ژنتیکی اضافی بایستی ارائه شود.
۲- تجزیه های ایزوآنزیمی:
از الکتروفورز ایزوآنزیم ها و الگوی باندی آنها به نحو گسترده ای برای اثبات هیبرید بودن استفاده می شود. ایزوآنزیم ها فرم های مولکولی مختلف یک آنزیم هستند که یک واکنش مشابه را کاتالیز می نمایند. در بررسی های ایزوآنزیمی، از ویژگی های الکتریکی پروتئینی ها و آنزیم ها برای جداسازی باندها در عمل الکتروفورز با ژل های نشاسته ای با ژل های پلی آکریلامید، استفاده می کنند.
الگوی باندهای ایزوآنزیمی هیبرید سوماتیکی ممکن است فقط مشابه باندهای اختصاصی والدین و یا ترکیبی از الگوی باندی هر دو والد باشد. آنزیم هایی که الگوی باندی منحصر به فرد متضادی در هر یک از گونه های والدینی دارند و برای شناسایی هیبریدهای سوماتیکی مورد استفاده قرار می گیرند که عبارتند از:
- استراز (Esterase)،
- اسپارتات آمینوترانسفراز (Aspartate aminotransferase)
- آمیلاز (Amylase)
- ایزوپروکسیداز فسفاتاز (Isoperoxidase phosphatase)
- الکل
- مالات
- لاکتات دهیدروژناز
- فسفودی استراز (Phosphodiaceterase).
اگر آنزیم مورد نظر دایمر (Dimeric) باشد، هیبرید سوماتیکی در الگوی ابندی خود، علاوه بر دو باند والدینی، یک باند هیبرید حدواسط دو باند والد را نیز نشان می دهد. ظهور باند حد واسط، احتمالا مبین تشکیل یک آنزیم دایمر هیبرید منحصر به فرد در هیبریدهای سوماتیکی می باشد.
از آنجا که ایزوآنزیم ها در بافت های گیاهی بسیار متغیر می باشند، در زمان مقایسه گیاهان والدی با هیبریدهای سوماتیکی، حتما بایستی از یک آنزیم مشابه برای همه گاهان و همچنین از بافت ها یا گیاهانی که در مرحله رشدی مشابه قرار دارند، استفاده شود. برای مقایسه نمونه ها، بایستی دیاگرام هایی از الگوی باندی ایزوآنزیمی، بنام زایموگرام (Zymogram) تهیه شوند و با دقت مورد بررسی قرار گیرند.
۳- ساختار کروموزومی:
شمارش کروموزوم ها در سلول های هیبرید احتمالی، یک روش آسان و مطمئن برای تأیید سلول های هیبرید است. با استفاده از این روش می توان اطلاعاتی نیز در مورد وضعیت پلوئیدی این سلول ها کسب کرد. از نظر سیتولوژیکی تعداد کروموزوم های یک هیبرید سوماتیکی بایستی برابر با مجموع تعداد کروموزوم های دو پروتوپلاست والدینی امتزاج یافته باشد. تغییر در تعداد کروموزوم های سلول های هیبرید ( آنیوپلوئیدی) عموما مشاهده می شود، اما غالبا تعداد کروموزوم های هیبرید از تعداد کل کروموزوم های هر دو پروتوپلاست والدی بیشتر است.
علاوه بر شمارش کروموزوم ها، اختلافات موجود در اندازه و ساختار کروموزوم ها نیز بایستی مورد بررسی قرار گیرد. حضور کروموزوم های نشانگر (Marker chromosomes)، بررسی وقایع ژنتیکی در سلول های هیبرید را تسهیل می نماید. برای شناسایی کروموزوم های خاص و مطالعه باز ترتیبی کروموزوم ها در سلول های هیبرید، می توان از تکنیک های نواربندی (Chromosome banding) استفاده گسترده ای به عمل آورد.
۴- روش های مولکولی:
پیشرفت های اخیر در تکنیک های بیولوژی مولکولی، توان ما را در تجزیه و تحلیل وضعیت ژنتیکی گیاهان هیبرید سوماتیکی، به نحو گسترده ای افزایش داده است. الگوهای برشی خاص DNAی میتوکندریایی و DNAی کلروپلاستی، برای مشخص کردن ماهیت پلاستوم ها (Plastoms) و کوندریوم های (Chondrioms) هیبریدهای سوماتیکی و سیبریدها مورد استفاده قرار گرفته اند. قطعات برشی DNAی هسته ای کد کننده RNAی ریبوزومی، که برای هر گونه ای به صورت اختصاصی می باشند، نشان داده اند که می توانند هیبریدهای سوماتیکی Nicotiana glauca+ N. longsdorffi را تأیید نمایند.
با در دسترس بودن نشانگرهای مولکولی متعدد نظیر RFLP ،AFLP ،RAPD و ریز ماهواره ها، شناسایی هیبریدها با استفاده از این تکنیک ها میسر می باشد. اینها روش های دقیقتری برای تجزیه بر اساس DNA هستند، چون هیچگونه اثر محیطی در بروز آنها دخالت ندارد. برای شناسایی هیبریدهای سوماتیکی بین سیب زمینی و گوجه فرنگی از نشانگرهای RFLP استفاده شده است. از تکنولوژی PCR نیز برای شناسایی هیبریدها استفاده شده است.
۵- خصوصیات ژنتیکی:
گیاهان هیبرید سوماتیکی که گل های بارور تولید می نمایند را می توان با روش های ژنتیکی مرسوم مورد بررسی قرار داد. نتایج به دست آمده از بررسی تفکیک صفات در نسل های F1 خویش آمیز شده، عموما با مقادیر مورد انتظار موافقت دارند و مدرک خوبی از ماهیت سوماتیکی گیاهان مورد بررسی فراهم می نماید.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید