تاریخ :۹ فروردین ۱۴۰۳
مراحل-تکنیک-RFLP

مراحل تکنیک RFLP

  • مراحل تکنیک RFLP

    مراحل تکنیک RFLP، شامل همسانه کردن ردیف های منحصر به فرد یا ردیف هایی است که دارای نسخه های کمی در ژنوم هستند و به عنوان کاوشگر از آنها استفاده می شود. ابتدا DNA ژنومی جداسازی می شود. برای استخراج DNA روش های مختلفی وجود دارد. ولی روشی برتر این است که بتواند مقدار بیشتری از DNA با کیفیت مطلوب تر را استخراج کند. پس از استخراج، DNA به کمک آنزیم ها برش داده می شود. کیفیت انگشت نگاری RFLP تا حد زیادی به برش کامل و دقیق نمونه های DNA بستگی دارد.

    عوامل موثر در انتخاب صحیح آنزیم های برشی در روش RFLP

    ۱- تا جایی که ممکن است باید از آنزیم های غیر حساس به متیل گذاری استفاده شود

    ۲- برای یوکارت ها و موجوداتی با اندازه ژنوم بزرگ تر بهتر است از آنزیم های ۶ بازبر و برای پروکاریوت ها و ژنوم های کوچکتر از آنزیم های ۴ تا ۶ باز بر استفاده شود

    ۳-  قیمت آنزیم های محدودگر متفاوت است و برخی از آنها بسیار گران اند. در صورتی که ترجیح خاصی وجود نداشته باشد، از آنزیم های ارزان تر استفاده شود.

     

    آنزیم-برشی-RFLP

    آنزیم های برشی در روش RFLP

     

    تهیه کاوشگر در تکنیک RFLP

    مراحل تهیه کاوشگر در تکنیک RFLP بدین صورت است که ابتدا DNA ژنومی توسط آنزیم محدودگر خاصی هضم و قطعه های حاصل در ناقل هایی (پلاسمید) که توسط همان آنزیم محدودگر برش داده شده اند، جاگذاری می شوند. این پلاسمیدها برای تکثیر و نگهداری به باکتری های آزمایشگاهی که اغلب از نوع اشریشیاکلی هستند، منتقل می شوند.

    همسانه های یاد شده توسط رادیوایزوتوپ ها یا با استفاده از روش های بیوشیمیایی پیچیده تر نشاندار شده و به عنوان کاوشگر برای شناسایی قطعه هایی متناظر در DNA ژنومی نمونه های متعددی که با آنزیم های محدودگر هضم شده و بر روی ژل آگاروز از هم جدا شده و به غشاهای نایلونی یا نیتروسلولز منتقل شده اند، مورد استفاده قرار می گیرند.

     

    تهیه کاوشگر در تکنیک RFLP

    تهیه کاوشگر در تکنیک RFLP

     

    اگر دو نمونه گیاهی را در نظر داشته باشیم که تنها و تنها یک نوکلئوتید آنها در نقطه برش خاصی با هم متفاوت باشند، آنزیم محدودگر ویژه آن نقطه برش، DNA استخراج شده از یکی از آن دو را برش خواهد داد و DNA نمونه دیگر در آن نقطه بدون برش باقی خواهد ماند.

    به این ترتیب قطعه های حاصل از برش توسط آنزیم های محدودگر دارای طول متفاوتی خواهند بود. این قطعه ها را می توان براساس اندازه شان از طریق الکتروفورز بر روی ژل از هم جدا کرد. پس از انتقال بر روی غشای نیتروسلوز و یا نایلونی از طریق دورگ گیری با قطعه مکمل خود (کاوشگر) که از طریق استفاده از مواد پرتوزا با روش های بیوشیمیایی دیگری نشاندار شده اند، قابل ثبت و مشاهده نمود.

    ابداع این روش، بی تردید نقشی اساسی در تحول علم رده بندی ایفا و موجب پیدایش شاخه های جدیدی در علم سیستماتیک موجودات زنده شده که با عنوان رده بندی ارقامی نامیده می شوند.

    محاسن تکنیک RFLP

    ۱-  تکرارپذیری، دقت و قابلیت اعتماد این نشانگر فوق العاده زیاد است.

    ۲- این نشانگر همبارز است و امکان تشخیص هر یک از انواع افراد خالص را از افراد ناخالص فراهم می آورد.

    نکته:

    جشنواره پاییزه
    جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع
    همین الآن خرید کنید

    در مورد تمام نشانگرهای مبتنی بر DNA ضروری است که بدانیم بیشتر نشانگرها حتى RFLP به ذات خودش می تواند بارز یا همبارز باشد. برای مثال در جایی که کاوشگر مورد استفاده نتواند در یکی از افراد، مکمل خود را پیدا کرده و به آن متصل شود، RFLP بارز خواهد بود. اما در بیشتر موارد این نشانگر همبارز است.

    ۳- فراوانی این نشانگر در حد بالایی است. تکنیک RFLP اجازه شناسایی چند شکلی ها در هر جایگاهی از ژنوم و در هر مرحله از رشد موجود را می دهند. از این رو ابزاری بسیار قوی در شناسایی تنوع به شمار می آیند. از این نشانگر به وفور در شناسایی بیماری ها نیز می توان استفاده کرد. 

    ۴- RFLP تحت تأثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد در صد ژنتیکی است.

    ۵-  امروزه تعداد زیادی از آنزیم های محدودگر با قیمت مناسب در دسترس اند که امکان شناسایی چند شکلی ها را در ژنوم افزایش می دهند.

    ۶- غشاهایی که توسط روش سادرن دی ان ای هضم شده به آنها منتقل شده است، می توانند به طور مکرر تا حدود ۲۰ مرتبه با DNA کاوشگر دورگ گیری شوند. بطوریکه پس از خودپرتونگاری و استخراج اطلاعات، می توان کاوشگر را حذف و دوباره از یک کاوشگر جدید استفاده نمود.

    ۷- اگرچه تهیه کاوشگرهای RFLP پر زحمت است، ولی گاهی اوقات می توان از کاوشگرهای یک گیاه برای گیاهان دیگر نیز استفاده نمود. برای مثال مانینن (۲۰۰۰) از همسانه های گندم، یولاف و برنج به عنوان کاوشگر در جو استفاده کرد.

    ۸- نتایج RFLP به راحتی قابل نمره دهی و تفسیر هستند.

    محاسن تکنیک RFLP

    محاسن تکنیک RFLP

    معایب روش RFLP

    ۱- دشواری، پیچیدگی و وقت گیر بودن آن.

    • تهیه کتابخانه های ژنومی یا cDNA به عنوان مخزن کاوشگر، نگهداری آنها، نشاندار کردن آنها
    • استخراج مقادیر زیاد DNA
    • انجام الکتروفورز
    • انتقال سادرن
    • دورگ گیری
    • خود پرتونگاری و…. مراحلی اند که در مجموع پیچیده و وقت گیرند.

    ۲- RFLP برای ژنوم های بزرگ نیازمند کاربرد مواد پرتوزا یا روش های پیچیده تر و گرانتر بیوشیمیایی است.

    ۳- تکنیک RFLP نیازمند نگهداری ریز سازواره ها به منظور تهیه کاوشگر است که خود بر پیچیدگی این روش می افزاید.

    ۴- هزینه اولیه زیاد و هزینه نسبتا زیاد نگهداری کاوشگرها و کاربرد آنها، RFLP را گران کرده است.

    منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.

     

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵

    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *