مراحل تکنیک نشانگر RAPD
باید توجه داشت که نمی توان جواب گرفتن را برای تمامی نمونه ها، تمامی آغازگرها و هر نوع دستگاه PCR تضمین کرد. بنابراین ابتدا حتما باید مراحل تکنیک نشانگر RAPD در آزمایشگاه بهینه شود. بهینه کردن اجزای PCR و شرایط دستگاه PCR به:
- اندازه ژنوم،
- مقدار GC آغازگر و الگو
- و کیفیت الگو بستگی دارد.
مراحل تکنیک نشانگر RAPD
۱- استخراج DNA
تاکنون روش های گوناگون برای استخراج DNA بیان شده است که از نظر کیفیت و کمیت DNA استخراج شده و نوع روش به کار رفته با هم تفاوت دارند. در هر صورت تهیه DNA الگوی با کیفیت مطلوب به منظور موفقیت در واکنش رپید حیاتی است. از این رو اختصاص دادن زمان کافی در بهینه کردن روش استخراج برای تهیه DNAهای عاری از آلودگی مفید خواهد بود.
۲- تخمین غلظت DNA
به منظور ایجاد یکنواختی در DNAهای مورد بررسی، باید غلظت اولیه DNA الگو تعیین و بهینه شود. معمولاً غلظت با یکی از دو روش اسپکتروفتومتری و یا الکتروفورز ژل آگاروز در مقایسه با نمونه های DNA با غلظت معلوم تخمین زده می شود.
۳ – انجام واکنش RAPD
برای انجام واکنش رپید ابتدا باید یک مخزن مخلوط از تمامی مواد PCR به جز DNA بر اساس تعداد واکنش ها، کنترل منفی (بدون DNA)، کنترل مثبت (DNA با الگوی شناخته شده) و در نظر گرفتن یک واکنش اضافی تهیه گردد. مخزن مخلوط این مزیت را دارد که موجب کاهش خطاهای مربوط به پیپت نمودن حجم های کم می شود. سپس پلیمراز Taq را به مخزن مخلوط اضافه کرده و آن را هم زنی می کنیم. پس از آن با تقسیم مخزن مخلوط براساس تعداد نمونه مورد بررسی تکثیر PCR را انجام می دهیم.
۴- الکتروفورز محصولات PCR
پس از تکثیر PCR می توان الگوی باندی نمونه ها را در ژل مناسب مورد بررسی قرار داد. در ژل آگاروز فقط نمونه های با حدود ۲۵-۱۵ باند قابل بررسی اند. در صورت بیشتر بودن تعداد باندها، بهتر است از ماتریس ژل پلی آکریلامید استفاده کرد. زیرا ژل پلی اکریلامید بهتر می تواند تفکیک باندها را انجام دهد. در نهایت باندها با رنگ آمیزی قابل مشاهده خواهند بود. اگر تعداد باند کمی در استفاده از یک نوع آغازگر به دست آید و یا تعداد آغازگرهای در دسترس کم باشد، می توان دو آغازگر را به صورت ترکیبی در یک واکنش PCR استفاده کرد.
نیمرخ بدست آمده از جفت آغازگرها (به صورت ترکیبی) هیچگاه نباید به همراه نیمرخ های بدست آمده از تک آغازگرها استفاده شود. زیرا امکان بدست آوردن محصولات یکسان افزایش و در نتیجه تنوع بین نیمرخ ها کاهش می یابد. در صورت مشاهده وضعیت لکه یا اسمیر با تراکم بالای بانددهی در نیمرخ RAPD می توان اقدامات زیر را انجام داد:
-
افزایش دمای اتصال
-
کاهش غلظت MgCl2
-
کاهش غلظت DNA الگو
-
کاهش مقدار آنزیم Taq پلیمراز
۵- تجزیه داده های RAPD
الگوی باندی حاصل از تجزیه RAPD براساس وجود یا عدم وجود باند خاص در نمونه ها، بصورت ۱ یا ۰ امتیاز دهی می شود. سپس براساس ماتریس صفر و یک فاصله یا شباهت ژنتیکی بین افراد با استفاده از ضرایب مختلف محاسبه می گردد. مقدار عددی ضرایب تشابه بین ۰ و ۱ است که مقدار صفر بیانگر عدم وجود باندهای مشترک (عدم تشابه ژنتیکی) و مقدار یک بیانگر الگوهای باندی یکسان (تشابه ژنتیکی کامل) است. ماتریس تشابه یا ماتریس فاصله بدست آمده را می توان به روش های متفاوت از جمله روش کلاستر مورد تجزیه و تحلیل قرار داد.
تفاوت در شدت بانددهی ممکن است به دلیل وجود چند کپی از ردیف های مورد تکثیر در ژنوم و یا به علت تکثیر همزمان قطعه های چندگانه متفاوت با اندازه یکسان باشد. در بیشتر گزارش ها از تفاوت در شدت بانددهی صرف نظر می گردد. ولی در حالتی که تفاوت در شدت بانددهی به واسطه وجود باند مشترک بین دو نمونه بعلاوه یک قطعه ثانویه با همان اندازه در یکی از نمونه ها، حتما باید تفاوت در شدت بانددهی را مد نظر قرار داد.
مزایای تکنیک نشانگر RAPD
در تکنیک RAPD نیازی به آگاهی از ردیف های DNA هدف نیست. زیرا روش RAPD بر مبنای تکثیر قطعه های تصادفی DNA انجام می شود، که از مهمترین مزیت این روش است.
معایب تکنیک نشانگر RAPD
- از آنجا که چند شکلی مشاهده شده براساس حضور یا عدم حضور قطعه تکثیر شده است، نشانگرهای RAPD در گروه نشانگرهای غالب قرار می گیرند. بنابراین تشخیص افرادی که دارای دو نسخه از یک آلل هستند، از افرادی که فقط یک نسخه از آن آلل را دارند، از طریق این نشانگرها امکان پذیر نیست.
- توارث غالبیت
- عدم وضوح باندها
- عدم تکرارپذیری بعضی از باندها
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران
دیدگاهتان را بنویسید