همان گونه که پیشتر گفته شد، ابداع و بهینه سازی ژل های نشاسته و رنگ آمیزی آنها تحولی اساسی در مطالعه آیزوزایم ها ایجاد کرد. مطالعه آیزوزایم توسط الکتروفورز ژل نشاسته شامل مراحل مختلفی است که در اینجا به طور مختصر به آن میپردازیم. البته مراحل زیر در ارتباط با نمونه های گیاهی می باشد ولی در کل برای سایر موجودات مشابه می باشد.
مرحله اول: جمع آوری بافت
پیش از آغاز مطالعه، باید نوع بافت و تعداد افرادی که مطالعه می گردند به دقت بررسی شوند. بهتر آن است که مطالعه آیزوزایم بر روی بافت های دیپلوئید صورت گیرد، زیرا تفسیر نتایج راحت تر است. استفاده از بافت های زنده بسیار ضروری است. اگرچه برخی از آنزیم ها ممکن است از بافت های مرده بازیافت شوند، اما تعداد آنها بسیار محدود می باشد. بهتر است استخراج آنزیم از بافت های جوان صورت گیرد، زیرا میزان ترکیبات ثانویه و آب در واحد حجم آن کمتر است. در برخی موارد، در هنگام جمع آوری نمونه ها بهتر است آنها را در یخ نگهداری کرد، اما باید از یخ زدگی آنها نیز جلوگیری به عمل آید. زیرا یخ زدگی و آب شدگی پس از آن ممکن است موجب از دست دادن برخی آنزیم ها شود. در غیر این صورت می توان نمونه ها را در فریزر قرار داد. بدین ترتیب در مطالعه آنزیم ها در گونه های مختلف بهتر است با توجه به آزمایش ها و نتایج قبلی به دست آمده اقدام کرد و یک رشته آزمایش های مقدماتی نیز انجام داد.
مرحله دوم: استخراج آنزیم
همانگونه که نخستین پژوهش ها درباره آیزوزایم ها نشان داد، آنها می توانند مختص به گونه، بافت، اندامک یا مرحله تکاملی معینی باشند. به این دلیل پس از انتخاب بافت و مرحله تکاملی خاص، باید در کل آزمایش ها آنها را ثابت نگه داشت. برای مثال اگر از برگ استفاده می شود، در کل آزمایش ها از برگ هایی که در همان مکان و ابعاد هستند نمونه برداری شود و همچنین مرحله رویشی و زمان نمونه برداری مشابه باشند.
روش هموژناز کردن بافت نیز به گونه و نوع بافت بستگی دارد. در برخی موارد، فقط استفاده از آب مقطر برای استخراج آنزیم ها کافی است، اما در موارد دیگر نیاز به بافرهای خاصی است تا ترکیبات زاید و مزاحم که تأثیر منفی بر آنزیم ها دارند از بین برده شوند.
مرحله سوم: الکتروفورز ژل نشاسته
انواع بسیار زیادی از بافرها برای الکتروفورز ژل نشاسته به کار برده می شوند. این بافرها ممکن است با توجه به نوع عامل بافری (مانند فسفات، سیترات، تریس)، pH، مولاریته، مدت زمان اجرای الکتروفورز، زمان نگهداری و عوامل دیگر متفاوت باشند. یک راهکار منطقی برای انتخاب نوع بافر مراجعه به مقالاتی است که بافرهای آنها جواب خوبی با موجود زنده مورد آزمایش داده اند.
نوع نشاسته مورد استفاده نیز از دیگر عوامل بسیار مهم در استفاده از این سیستم است. باتوجه به اینکه نشاسته محصولی بیولوژیکی است، ممکن است از یک سری به سری دیگر فرق کند و پاسخ های متفاوت بدهد. نشاسته مورد استفاده (وزن به حجم) بین ۱۴ – ۱۲٪ تغییر می نماید. درصد کمتر ممکن است به علت پارگی در جابه جایی ژل مشکل ایجاد کند.
مرحله چهارم: رتبه بندی الگوی باندی
تفسیر باندهای حاصل از الکتروفورز و رنگ آمیزی بعدی ژل را در اصطلاح رتبه بندی می گویند. تفسیر دقیق ژل ها اغلب به تجربه کافی نیاز دارد، به ویژه زمانی که تعداد زیادی باند بر روی ژل قرار دارند و باندها (آنزیم ها) حاصل مکان های ژنی متفاوت باشند. برخی از آنزیم ها محصول بیش از یک ژن هستند، از این رو محصولات این ژن ها با یکدیگر جمع می شوند تا یک آنزیم را تشکیل دهند که ممکن است یک دایمر، ترایمر یا تترامر باشد. همچنین منشأ محصولات ژنی که آنزیم را تشکیل می دهند، ممکن است از یک یا چند جایگاه ژنی باشد.
روش های مختلفی برای ثبت آلل های بدست آمده روی یک ژل وجود دارد. یک روش، اختصاص دادن یک حرف به هر آلل است که از آندی ترین آلل شروع شده و به کاتدی ترین آلل ختم می شود. مشکلی که در این روش با آن مواجهیم این است که با شناسایی یک آلل جدید، باید حروف سایر آلل ها را نیز عوض کرد. بدین علت بسیاری از محققان از قابلیت حرکت نسبی برای هر آلل استفاده می کنند. در این حالت به هر کدام از آلل ها یک عدد دائمی اختصاص داده می شود که نشان دهنده درصد فاصله مهاجرت یک استاندارد شناخته شده است.
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.
دیدگاهتان را بنویسید