تعیین بازده تکثیر در PCR
تعیین بازده تکثیر در PCR: برای مقایسه نتایج بین نمونه‌های مختلف، ضروری است که بازده تکثیر را برای هر جفت آغازگر بدانید. واکنش PCR که بازده ۱۰۰% دارد، در هر چرخه محصول را دو برابر می‌کند. در هر حال، چندین عامل می‌تواند با بازده تکثیر PCR تداخل کنند و باعث شوند که بازده زیر ۱۰۰%، حتی در چرخه‌های اول شود. چنین عامل‌هایی شامل ساختار دوم در الگو، مواد آلوده‌کننده در طی تهیه الگو یا شرایط بهینه‌سازی ضعیف باشد.
برای ارزیابی دقیق تفاوت بین نمونه‌ها، توصیه می‌شود که بازده تکثیر هر جفت آغازگر در شرایطی که استفاده خواهد شد تعیین شود. زمانی که بازده تکثیر تعیین شد، می‌توان از آن برای اصلاح منبع خطای بالقوه، قبل از انجام مقایسه‌ها استفاده نمود. روشی که اینجا به‌طور خلاصه آورده می‌شود، مقیاسی را برای بازده تکثیر ارائه می‌دهد که می‌توان در روش تعیین مقدار نسبی که توسط فافل (۲۰۰۱) ارائه‌شده، استفاده شود.
مواد مورد نیاز آزمایش تعیین بازده تکثیر در PCR
نمونه‌های cDNA یا نمونه‌های DNA دیگر برای تعیین بازده تکثیر.
مخلوط مادری PCR
- مخلوط واکنش ۲X
- ۵۰ میکرو مولار آغازگر رفت
- ۵۰ میکرو مولار آغازگر برگشت
- آب عاری از RNase
- تیوب‌های میکرو سانتریفیوژ ۱/۵ میلی‌لیتری (برای تهیه کردن مخلوط مادری)
- تیوب‌های PCR دیواره نازک
- ترمال سایکلر زمان واقعی
- مواد اضافه و دستگاه برای تهیه cDNA
- مواد را همان‌طور که بیشتر توضیح داده شد مخلوط‌کنید و روی یخ قرار دهید.
- یک سریال رقت از نمونه DNA تهیه کنید که دارای توالی است که باید تکثیر شود.
روش کار آزمایش
۱- یک مخلوط مادری در تیوب‌های ۱/۵ میلی‌لیتری برای PCR نمونه تا زمانی که با تیوب‌های زیادی کار می‌کنید، یکنواختی را به حداکثر و زحمت را به حداقل برسانید. به‌طور معمول، هر درجه رقت در سه تکرار انجام می‌شود. مخلوط‌های مادری را می‌توان بیشتر ازآنچه که نیاز است، ساخت تا اختلاف در پیپت کردن به‌حساب آورده شده باشد.
۲- مخلوط مادری را کاملاً مخلوط‌کنید، کوتاه سانتریفیوژ کنید تا مواد پخش‌شده یکجا جمع شوند و مقدار برابری را در هر تیوب دیواره نازک PCR توزیع کنید.
۳- به هر کدام از تیوب‌های واکنش الگوهای رقیق‌شده سریالی را به مقدار لازم اضافه کنید. مطمئن شوید که یک کنترل منفی که الگویی در آن نیست داشته باشید.
۴- دستگاه PCR را روشن و طبق دستور سازنده برنامه را تنظیم کنید.
۵- یک آنالیز منحنی ذوب DNA را می‌توان پس از مرحله گسترش ۷۲ درجه سانتیگراد اضافه کرد تا از اختصاصی بودن واکنش PCR مطمئن شد.
۶- تیوب‌ها را در دستگاه ترمال سایکلر قرار دهید و برنامه را شروع کنید.
۷- واکنش PCR را ران کنید تا مقدار CT را برای هر رقت تعیین کنید.
۸- نمودار مقدار CT را در مقابل لگاریتم غلظت یا نمونه الگو رسم کنید. این مقدارها می‌توانند اختیاری باشند و ارتباط بین سریال رقت را نشان دهند. برای نمونه ۱، ۱۰، ۱۰۰، ۱۰۰۰ و غیره. خطی که از میان این نقطه کشیده می‌شود باید مقدار R۲ بالایی (۰/۹۹ <) داشته باشد و معرف میزان انطباق گذشتن خط از میان نقطه‌های داده‌شده باشد.
۹- از شیب‌خط برای تعیین بازده واکنش PCR استفاده کنید.اگر نیاز است برای آغازگرهای دیگر نیز تکرار کنید.
۱۰- داده‌های بازده تکثیر را برای هر جفت آغازگر ثبت کنید.
دیدگاهتان را بنویسید