تکنیک Hot start PCR

تکنیک Hot start PCR عبارتند از جدا کردن یک یا چند ترکیب مهم PCR، ترجیحا آنزیم پلیمراز. به طوری که بلافاصله بعد از دناتوراسیون DNA هدف، به واکنش اضافه می شوند. استفاده از PCR gem و آنتی بادی آنزیم پلیمراز. این روش فرآیندی است که می‌تواند احتمال تکثیر قطعات غیراختصاصی را در PCR کاهش داده و میزان تولید محصول موردنظر را افزایش دهد. تکثیر این قطعات ناشی از شروع زودهنگام واکنش در دماهای پایین قبل از آغاز آن است.

نخستین متدهای hot start PCR از طریق اضافه نکردن تعدادی از مواد اولیه مانند آنزیم پلیمراز و یا کوفاکتور منیزیم در مرحله آماده‌سازی مخلوط واکنش و بصورت دستی انجام می‌‌گرفت. افزودن این مواد زمانی انجام می‌گرفت که مخلوط واکنش به دماهای بالای چرخه حرارتی در نخستین دناتوراسیون (حدود ۸۰ درجه سانتیگراد) می‌رسید. به عنوان مثال ابتدا دمای واکنش را افزایش داده و سپس با بیرون آوردن مخلوط از دستگاه ترمال سایکلر، به لوله‌ها آنزیم اضافه می‌کردند.

هدف و کاربرد استفاده از روش Hot start PCR

Hot start PCR در مواقعی مفید است که تکثیر غیراختصاصی به علت وجود مقادیر بسیار کم DNA الگو، پیچیده بودن توالی آن مثلا در long PCR و استفاده از جفت پرایمرهای متعدد مثلا در multiplex PCR مشکل‌ساز باشد. همچنین این تکنیک در RT-PCR بسیار حیاتی است و می‌تواند برای تکثیر توالی‌های پیچیده کمک‌کننده باشد.

Hot Start PCR تکنیکی است که تکثیر غیر اختصاصی را کاهش می دهد و به راحتی واکنش تنظیم شده در دمای اتاق را فراهم می کند. پلیمرازهای مورد استفاده در Hot Start PCR در دمای محیط غیرفعال هستند. فعالیت پلیمراز را می توان در این دما از طریق مکانیسم های مختلف از جمله:

برهمکنش آنتی بادی،
اصلاح شیمیایی
و فناوری آپتامر مهار کرد.

استفاده از DNA پلیمرازهای Hot Start اغلب برای کاربردهای با بازدهی بالا و آزمایشاتی که به درجه بالایی از حساسیت و ویژگی نیاز دارند، توصیه می شود.

انواع تکنیک Hot start PCR

۱- Hot start به کمک آنتی بادی

مونوکلونال آنتی بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه می کنند. در نتیجه فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار می کند. هنگامی که دمای واکنش به ۹۴ درجه سانتی گراد می رسد، آنتی بادی دناتوره می شود و دوباره پلیمراز فعال می شود.

۲- Hot start به کمک Ampliwax

به دیواره لوله های مخصوص این کار به نوعی واکس آغشته است که بعد از کمی گرم کردن ذوب شده و روی واکنش را می پوشاند. آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار می دهند. در دمای ۹۴ درجه سانتیگراد این واکس بخار می شود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا می کند.

این تکنیک در ابتدا به عنوان روشی برای متوقف ساختن عملکرد تکثیری DNA پلیمراز در دماهای پایین به کار می‌رفت. اما امروزه روش‌های دیگری نیز توسعه یافته‌اند که مواد اولیه اصلی واکنش را مورد هدف قرار داده و به این ترتیب عملکرد PCR را با جلوگیری از تکثیر قطعات غیر هدف بهبود می‌بخشد. از جمله این مواد اولیه واکنش می‌توان به: