تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
  • تکنیک Multiplex-PCR

    تکنیک Multiplex-PCR :Multiplex PCR یک روش زیست شناسی مولکولی گسترده برای تکثیر اهداف متعدد در یک آزمایش PCR است. در این روش می توان با استفاده از چندین جفت آغازگر در یک مخلوط واکنش، بیش از یک توالی هدف را تکثیر کرد. این روش به عنوان توسعه عملی از PCR، امکان صرفه جویی قابل توجهی در زمان و تلاش در آزمایشگاه را دارد، بدون آنکه به کاربرد این آزمایش آسیب برساند.

    انواع تکنیک Multiplex-PCR

    ۱- واکنش PCR با یک DNA الگو

    این روش از یک DNA الگوی واحد استفاده می کند که می تواند مناطق خاصی از یک DNA ژنومیک را به همراه چندین جفت آغازگر رفت و برگشت تکثیر کند.

    ۲- واکنش PCR با چندین DNA الگو

    در این روش از چندین الگو و چندین مجموعه آغازگر در یک لوله واکنش استفاده می شود. وجود چندین آغازگر ممکن است منجر به ترکیبی متقاطع با یکدیگر و امکان پرایمرینگ اشتباه با الگوهای دیگر شود.

    Multiplex-PCR

    پارامترهای طراحی آغازگر برای Multiplex-PCR

    طراحی مجموعه های آغازگر خاص برای یک واکنش موفق ضروری است. ملاحظات مهم طراحی آغازگر که در زیر شرح داده شده، کلیدی برای تکثیر خاص با عملکرد بالا هستند.

    ۱- طول آغازگر

    سنجش مالتی پلکس PCR شامل طراحی تعداد زیادی از آغازگرها است، بنابراین لازم است که آغازگر طراحی شده از طول مناسب برخوردار باشد. معمولاً از آغازگرهای با طول کوتاه، در محدوده ۱۸-۲۲ جفت باز استفاده می شود.

    ۲- دمای ذوب

    از آغازگرهایی با Tm مشابه ترجیحاً بین ۵۵ تا ۶۰ درجه سانتیگراد استفاده می شود. برای توالی هایی با محتوای GC بالا، آغازگرهایی با Tm بالاتر (ترجیحاً ۷۵ درجه سانتی گراد – ۸۰ درجه سانتی گراد) توصیه می شود. یک تغییر TM بین ۳ تا ۵ درجه سانتیگراد برای آغازگرهای مورد استفاده قابل قبول است.

    ۳- ویژگی

    در نظر گرفتن ویژگی آغازگرهای طراحی شده برای توالی های هدف، ضمن تهیه روش سنجش تکنیک مالتی پلکس PCR، خصوصاً از آنجا که رقابت در زمانی که توالی های چند هدف در یک ظرف واکنش واحد وجود داشته باشد، از اهمیت بسیاری برخوردار است.

    ۴- از تشکیل پرایمر- دایمر خودداری کنید

    آغازگرهای طراحی شده باید از نظر تشکیل دایمرهای آغازگر، با تمام آغازگرهای موجود در مخلوط واکنش، بررسی شوند. دایمر شدن منجر به تکثیر نامشخص می شود. تمام پارامترهای دیگر مشابه دستورالعمل های استاندارد آغازگر PCR است.

    معرفی-Multiplex-PCR

    مزایای تکنیک Multiplex-PCR

    ۱- کنترل های داخلی

    مشکلات احتمالی در یک PCR ساده شامل منفی شدن کاذب به دلیل شکست واکنش یا مثبت شدن کاذب ناشی از آلودگی است. منفی های کاذب اغلب در سنجش های مالتی پلکس PCR آشکار می شوند، زیرا هر آمپلیکون یک کنترل داخلی برای سایر قطعات تکثیر شده فراهم می کند.

    ۲- کارایی

    هزینه معرف ها و زمان آماده سازی در مالتی پلکس PCR کمتر از سیستم هایی است که چندین لوله PCR uniplex استفاده می شود. یک واکنش مالتی پلکس PCR برای حفظ هزینه های پلیمراز و قالب های کم هزینه بسیار ایده آل است.

    ۳- نشانگر کیفیت الگو

    کیفیت الگو ممکن است در مالتی پلکس PCR به طور موثرتری نسبت به یک واکنش PCR ساده تعیین شود.

    ۴- نشانگر مقدار الگو

    از تکثیر نمایی و استانداردهای داخلی multiplex PCR می توان برای ارزیابی مقدار یک الگوی خاص در یک نمونه استفاده کرد. برای کمّیت دقیق الگوها توسط multiplex PCR، مقدار الگوی مرجع، تعداد چرخه واکنش و حداقل مهار دو برابر شدن محصول برای هر چرخه باید محاسبه شود.

    مکانیسم-Multiplex-PCR

    کاربردهای تکنیک Multiplex-PCR

    ۱- شناسایی پاتوژن

    ۲- ژنوتیپ SNP با توان بالا

    ۳- تجزیه و تحلیل جهش

    ۴- تجزیه و تحلیل حذف ژن

    ۵- کمّی سازی الگو

    ۶- آنالیز لینکاژ

    ۷- تشخیص RNA

    ۸- مطالعات پزشکی قانونی

    ۹- طراحی آغازگر PCR چندگانه با نرم افزار  PrimerPlex

    ** PrimerPlex نرم افزاری کارآمد برای طراحی الیگوهای خاص برای سنجش های مالتی پلکس PCR است. این برنامه الیگوها را از نظر واکنش متقاطع بررسی می کند و عدم تطابق TM را به حداقل می رساند تا بهترین مجموعه ممکن را برای شما فراهم کند.**

    منبع: www.premierbiosoft.com

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.