تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
  • تکنیک Long Range PCR

    به روش سنتی، تکنیک Long Range PCR با استفاده از مخلوطی از آنزیم DNA Taq polymerase برای طویل سازی سریع همراه با میزان کمی از آنزیم پلیمراز با فعالیت تصحیح انجام شده است. این آنزیم، عدم تطابق DNA موجود در انتهای ‘۳ این رشته در حال سنتز را ترمیم می کند و به DNA Taq polymerase اجازه می دهد تا سنتز DNA را بیشتر از حد تعیین شده ادامه دهد. در نتیجه باعث افزایش بیشتر تکثیر DNA می شود. همچنین روش Long Range PCR می تواند با استفاده از پلیمرازهای اصلاح شده با دقت بالا و ارتقاء عمل اتصال به DNA، و در نتیجه تکثیر بسیار پردازشی و دقیق، قطعات طولانی حاصل شود.

    • در سال ۱۹۹۴، Barnes روشی را برای نخستین بار بکار گرفت:

    انجام PCR با مخلوطی از دو نوع DNA پلیمراز:

    ۱- ترکیب اصلی، یک DNA پلیمراز با کارایی بالا

    ۲- ترکیب دوم یک DNA پلیمراز دارای خاصیت تصحیح اگزونوکلئازی در جهت ’۳ به ’۵ بود.

    این روش می‌تواند میزان جفت شدن نادرست بازها را طی سنتز DNA کاهش داده و تکثیر قطعات DNA را در مرحله گسترش افزایش دهد. در نتیجه، تکثیر DNAهای الگو با طول بیش از ۳۵ کیلوباز به نحو موثری ممکن شد.

    چه برای کلون سازی، نقشه برداری از ژنوم یا تعیین توالی، PCR Biosystems دارای طیف وسیعی از راه حل ها است که امکان تکثیر قطعات طویل را با سرعت بالا فراهم می کند. با این روش قطعات بیش از ۲۰ کیلوجفت باز همانند سازی می شوند. برای انجام این تکنیک باید DNA ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشد و پرایمرها به دقت طراحی شوند. برای این کار از آنزیم Klontaq استفاده می شود. این آنزیم نسخه ای از DNA polymerase است که قسمت N ترمینال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت ۱۸۰ به ۱ مخلوط می شود و فاقد خاصیت ‘۵ اگزونوکلئازی است.

    روش های بهینه سازی تکنیک Long Range PCR

    ۱- بهینه سازی بافر

    با افزایش PH می توان دقت در تکثیر DNA  پلیمرازهای دارای خاصیت اگزونوکلئازی را افزایش داد. برای مثال، برخلاف DNA پلیمرازهای فاقد تصحیح اگزونوکئازی، انواع DNA پلیمرازهای مورد استفاده در روش Long PCR، با افزایش pH دقتشان در تکثیر بیشتر می‌شود.

    ۲- شرایط چرخه حرارتی

    افزایش سرعت چرخه حرارتی و تغییر سریع تر دمای چرخه واکنش باعث بهبود تکنیک Long PCR میشود. همچنین به آنزیم های پلیمراز بایست زمان کافی برای پر کردن فاصله بین نقاط اتصال پرایمر داده شود. حداکثر فعالیت آنزیم در محدوده دمایی ۸۰-۷۵ درجه سانتیگراد می‌باشد. با افزایش دما، فعالیت پلیمراز به طور محسوسی کاهش می‌یابد. این کاهش به علت دناتوره شدن رشته‌های الگوی DNA رخ می‌دهد. فعالیت آنزیم در در دماهای پایین‌تر نیز کاهش می‌یابد.

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.