تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
پروتکل جداسازی و امتزاج پروتوپلاست گیاه توتون

پروتکل جداسازی و امتزاج پروتوپلاست گیاه توتون

  • جداسازی پروتوپلاست ماده گیاهی توتون:

    ۱- برگ های کاملا رشد یافته را با دمبرگ جدا نموده و آنها را در محلول ۱۰٪ هیپو کلریت اسدیم تجارتی محتوی دو قطره ۲۰ Tween بمدت ۱۰ دقیقه استریل نمایید و پس از ۴-۳ بار شستشو با آب مقطر استریل، سطح آنها را بر روی کاغذ صافی استریل قرار دهید تا آبگیری شوند.
    ۲- اپیدرم پائینی را با استفاده از یک انبرک نوک تیز ظریف از برگ های استریل جدا نمایید و سپس با یک اسکالپل ظریف، برگ ها را به چند قطعه برش دهید.
    ٣- قطعات برگ را فقط مناطق پوست گیری شده در وضعیتی که سطح پایینی آنها به سمت پایین باشد، در ۳۰ میلی لیتر محیط کشت شستشوی سلول و پروتوپلاست (CPW) حاوی ۱۳٪ مانیتول در یک پتری دیش به مدت ۶۰-۳۰ دقیقه جهت پلاسمولیز قرار دهید.
    ۴- محلول نمکی، مانیتول-CPW را با پیپت پاستور حذف و آن را با ۲۰ میلی لیتر محلول ۱۳ درصد مانیتول حاوی۰/۱-۰/۵ درصد ماسروزیم ( macerozyme) و ۱-۰/۵ درصد سلولاز (cellulase) جایگزین نمایید.
    ۵- برای تسهیل در آزاد شدن پروتوپلاست ها، قطعات برگ را با یک پیپت پاستور به آرامی اهم بزنید. قطعات بزرگتر را به یک سمت برانید و پتری دیش را با یک زاویه تقریبا ۱۵ درجه نگهدارید، یا با عبور دادن مخلوط از فیلتری با قطر روزنه ۸۰-۶۰ میکرومتر، زوائد بزرگتر را جدا نمایید.

    ۶- مواد رد شده از صافی را به یک لوله سانتریفیوژ درپیچ دار انتقال دهید.
    ۷- با دور ۱۰۰×g به مدت ۱۰- ۵ دقیقه سانتریفیوژ نمایید تا پروتوبلاست ها رسوب کنند. محلول رویی را خارج نموده و توده پروتوپلاست را مجددا در محلول CPW محتوی ۲۱٪ ساکارز به حالت سوسپانسیون در آورید و به آرامی پروتوپلاست ها را در محلول پخش نمایید.
    ۸- دوباره با دور ۱۰۰×g به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ نمایید. پروتوپلاست های زنده در سطح محلول ساکارز شناور خواهند شد، در حالی که سلول های باقیمانده و مواد زائد، در ته لوله سانتریفیوژ رسوب می کنند.
    ۹- لایه پروتوپلاست ها را از سطح محلول با استفاده از یک پیت پاستور برداشته و به لوله سانتریفیوژ دیگری انتقال دهید. پروتوپلاست ها را در محلول CPW محتوی ۱۰٪ مانیتول بصورت سوسپانسیون در آورید و مجدا با دور g×۱۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ نمایید تا مواد زائد آلوده کننده جدا شوند.
    ۱۰- روش شستشو را حداقل یک مرتبه تکرار کنید.
    ۱۱- بعد از آخرین مرحله شستشو، مقداری محیط کشت MS ویژه پروتوپلاست محتوی ۹٪ مانیتول را به مجموعه پروتوپلاست ها بیافزائید تا تراکم سلول ها در سوسپانسیون حاصله به حد تقریبی۱۰ ×۵ به توان ۴ سلول در هر میلی لیتر برسد. سوسپانسیون پروتوپلاستی را بصورت قطرات کوچک ۱۰۰ – ۱۵ میکرولیتری و یا یک لایه بسیار نازک در پتری دیش های کوچک پخش کرده و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۲۵°C نگهداری نمایید.
    ۱۲- کشت ها را تحت تابش نور با شدت ۵۰۰ لوکس به مدت ۲ روز قرار دهید و سپس تا پایان آزمایش شدت نور را به ۲۰۰۰ لوکس افزایش دهید.
    ۱۳ – پروتوپلاست ها به تشکیل دیواره سلولی پرداخته و پس از ۵-۳ روز تقسیم سلولی را شروع می نمایند.
    ۱۴- پروتوپلاست ها را در محیط کشت محتوی آگارز نیز می توان کشت داد. بدین ترتیب که ۱/۵ میلی لیتر سوسپانسیون پروتوپلاستی را با همین مقدار محیط کشت آگارز ۱/۲ درصد در دمای ۴۵°C در یک پتری دیش ۳۵ میلیمتری مخلوط کنید.
    ۱۵- کشت ها به رشد خود ادامه داده و اولین کلنی ها ۴-۳ هفته بعد ظاهر می شوند.
    ۱۶- کلنی ها را به محیط کشت جدید محتوی غلظت کمتری از مانیتول انتقال دهید.
    ۱۷- برای تمایز جنین و باززایی گیاهچه، کلنی ها را به یک محیط کشت مناسب منتقل نمایید.

    جداسازی پروتوپلاست

    پروتکل امتزاج پروتوپلاست های گیاه توتون:

    • تیمار امتزاج: PEG
    • مواد گیاهی: برگ سبز (مزوفیل) و سلول های کشت شده (آلبینو) از توتون

    ۱- آزمایش امتزاج را پس از جداسازی پروتوپلاست ها انجام دهید.
    ۲- یک مخلوط ۶-۴ میلی لیتری سوسپانسیون پروتوپلاستی تازه با تراکم ۵۸۱۰ سلول بر میلی لیتر در محلول نمکی CPW محتوی ۱۳٪ مانیتول (CPW13M) از هر دو منبع پروتوپلاست بردارید. سوسپانسیون پروتوپلاستی مخلوط را در یک لوله سانتریفیوژ در پیچ دار به نسبت ۱۰۱ تهیه نمایید.
    ۳- با استفاده از پیپت پاستور، قطره کوچکی از سیلیکون استریل را در مرکز یک پتری دیش پلاستیکی mm ۳۵ قرار داده و یک لامل شیشه ای را به آرامی بر روی آن قرار دهید.
    ۴- حدود ۱۵۰ میکرولیتر سوسپانسیون پروتوپلاستی را در مرکز لامل شیشه ای قرار داده و ۱۰ – ۱۵ دقیقه صبر کنید تا پروتوپلاست ها ته نشین شوند.
    ۵- با استفاده از پیپت پاستور، ۴۵۰ میکرولیتر از محلول تلفیقی PEG بردارید. یک قطره از این محلول را در حاشیه توده پروتوپلاست ها و قطره دیگری در وسط آنها خالی نمایید.

    • ترکیب محلول تلفیقی PEG به قرار زیر است:
    1. ۲۲/۵ درصد پلی اتیلن گلیکول با وزن مولکولی ۶۰۰۰
    2. ۱/۸ ساکارز
    3. ۱۵۴ میلی گرم بر لیتر CaCl2.2H2O
    4. ۹/۵۲ میلی گرم بر لیتر KH2PO4

    ۶- پس از تنظیم pH محلول به ۵/۸ با استفاده از HCI یا KOH یک مولار، آن را اتو کلاو نموده و در تاریکی و دمای C° ۴ نگهداری مینمایند.

    ۷- پروتوپلاست ها (مخلوط امتزاج) را به مدت ۴۰-۲۰ دقیقه در دمای اتاق به حال خود رها کنید و سپس در حالی که مقداری از محلول تلفیق را از مخلوط امتزاج برمی دارید، یک قطره محلول شستشو را بتدریج به آن اضافه کنید. این عمل (حذف اندکی از محلول تلفیق و جایگزینی یک قطره محلول شستشو) را به مدت ۲۰ دقیقه در فواصل زمانی هر ۵ دقیقه تکرار نماید.

    جشنواره پاییزه
    جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع
    همین الآن خرید کنید

    عدم صدمه دیدن پروتوپلاست ها و اجتناب از آشفتگی آنها در این مرحله بسیار مهم است. محلول شستشو را با افزودن CaCl2 . 2H20 به محلول CPW 13M به مقدار ۰/ ۷۴ گرم بر لیتر تهیه نمایید.

    ۸- پنج دقیقه پس از آخرین شستشو، محلول را با یک پیپت پاستور به دقت کشیده و فقط پروتوپلاست ها را بر جای گذارید. آنگاه مقداری محیط کشت پروتوپلاستی MS محتوی ۹٪ مانیتول بجای محلول شستشو جایگزین نمایید. عمل شستشو با محیط کشت را نیز سه مرتبه تکرار کنید‌.

    مرحله کشت پروتوپلاست ها:

    ۹- برای کشت پروتوپلاست ها، لامل شیشه ای حامل مخلوط امتزاج را در محیط کشت، غوطه ور نمایید، بطوریکه لایه نازکی از محیط کشت، کف پتری دیش را بپوشاند. چند قطره از محیط کشت را با پیپت برداشته و بصورت قطره قطره از ارتفاع کم به پتری دیش برگردانید تا پراکندگی مطلوبی حاصل شود.
    ۱۰- کشت ها را در ابتدا به مدت ۲۴ ساعت در تاریکی و دمای ۲۵°C قرار داده و سپس آنها را در معرض تابش نور سفید با شدت ۱۰۰۰ لوکس قرار دهید. فرآورده های تلفیق را می توان براحتی در زیر میکروسکوپ معکوس مشاهده کرد.
    ۱۱- کلنی های حاصل را به محیط کشت باززایی انتقال دهید.
    ۱۲- بسته به امکانات موجود در آزمایشگاه، هیبرید بودن فرآورده های تلفیق و هیبریدهای سوماتیکی را بررسی نمایید.

    منبع:  کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.