مراحل خالص سازی پروتوپلاست
- مخلوط حاصل از هضم آنزیمی در مرحله اول ترکیبی از مواد زائد سلولی، سلول های سالم، و پروتوپلاست های صدمه دیده و پروتوپلاست های سالم خواهد بود. این مخلوط با استفاده توام از فیلتراسیون، سانتریفیوژ و شستشو، خالص سازی می شود.
- محلول آنزیمی که محتوی پروتوپلاست ها است از درون یک فیلتر نایلونی یا صافی از جنس استیل ضد زنگ با قطر سوراخ ۱۰۰-۵۰ میکرون عبور داده می شود، تا ذرات درشت که شامل بافت های هضم نشده و توده های سلولی می باشند، جدا شوند.
- محلول فیلتر شده که مخلوطی از آنزیم و پروتوپلاست است، با حجم مناسبی از ساکارز در یک سوسپانسیون پروتوپلاستی مخلوط می شود، تا به غلظت نهایی در حدود ۲۰ برسد و سپس تحت سانتریفیوژ با دور ۱۰۰×g به مدت ۱۰-۷ دقیقه قرار می گیرد.
- مواد زائد سلولی در ته لوله سانتریفیوژ رسوب می نمایند و پروتوپلاست ها به صورت یک باند در مرز تماس ساکارز و محیط سوسپانسیونی ظاهر می گردند.
- باند پروتوپلاستی به راحتی توسط پیپت پاستور به درون لوله سانتریفیوژ دیگری منتقل می شود.
- پس از سانتریفیوژ و سوسپانسیون مجدد، پروتوپلاست ها را سه مرتبه می شویند و در نهایت آنها را در یک محیط کشت مناسب با تراکم مطلوب به حالت سوسپانسیون در می آورند.
شیب های غلظت دیگری نیز برای کمک به جداسازی پروتوپلاست ها پیشنهاد شده اند:
۱- شیب غلظت دو مرحله ای فیکول (Ficoll) (پلی ساکارز) با غلظت ۰/۶ در بخش فوقانی و ٪۹ در بخش تحتانی، محلول در محیط کشت MS با ۷٪ سوربیتول و سانتریفیوژ با دور g×۱۵۰ به مدت ۵ دقیقه پیشنهاد شده است. پس از سانتریفیوژ، مواد زائد سلولی در ته لوله رسوب می نمایند و پروتوپلاست ها در بخش فوقانی شناور می مانند.
２- پروتوپلاست ها را می توان در پرکول ۲۰ (Percoll) با ۰/۲۵ مول مانیتول و ۰/۱ مول کلى ید کلسیم نیز جدا کرد. پس از انجام سانتریفیوژ، پروتوپلاست ها را در بالای پرکل می توان بازیافت نمود. از آنجا که مواد با وزن مولکولی زیاد مانند فیکول و پرکول از نظر اسمزی بی اثر هستند، استفاده از آنها بر ساکارز برای شناور ساختن پروتوپلاست ها ترجیح داده می شود.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید