ریزماهواره های نشانمند از ردیف یا STMS
در سال ۱۹۸۹ چندین گروه تکثیر ریزماهواره را از طریق PCR یک جایگاه خاص مطرح کردند که بعدها توسط بک من وسولر ریزماهواره های نشانمند از ردیف یا STMS (sequence tagged microsatellites sites) نامیده شد. روش STMS برای شناسایی چند شکلی های ریزماهواره ای در مطالعات ژنتیک بسیار مورد استفاده قرار می گیرد. در حقیقت در این روش از PCR برای شناسایی تغییرات درون یک جایگاه ژنی که به صورت همبارز توارث می یابند، استفاده می شود. این روش شامل مراحل غربال کردن کتابخانه ژنومی برای ردیف های ریزماهواره ای، ردیف یابی همسانه های مثبت، طراحی آغازگرهای مجاور ناحیه ریزماهواره و تکثیر ژنوم با این آغازگرهاست.
از آنجاییکه نواحی مجاور ریزماهواره ها در گونه های یک جنس و حتی در برخی موارد در جنس های نزدیک حفظ شده است، براساس این نواحی میتوان آغازگرهایی را طراحی کرد که در اصطلاح، آغازگرهای مجاور ریزماهواره نامیده میشوند. در حقیقت برای تکثیر یک جایگاه ژنی ریز ماهواره از آغازگرهای الیگونوکلئوتید اختصاصی نواحی غیر تکرار شونده در امجاور نواحی تکرار شونده ریزماهواره استفاده میشود. این روش که مبتنی بر آغازگرهای مجاور ریزماهواره است، ریزماهواره های نشانمند از ردیف نامیده می شود.
تجزیه STMS نخستین بار در گیاهان توسط آکایا” و همکاران (۱۹۹۲) در سویا انجام گرفت. آنها با تجزیه ردیف های تکراری AT و ATT مربوط به بانک اطلاعات سویا، توانستند بین ۶ تا ۸ آلل را در هر جایگاه ژنی شناسایی کنند. با شناسایی این نشانگرها در گیاهان دیگر، استفاده از آنها در اصلاح گیاهان و همچنین ژنتیک جمعیت به سرعت افزایش یافت.
ویژگی ریزماهواره های نشانمند از ردیف یا STMS
- تعداد نوکلئوتیدها در هر واحد تکرار، برای بیشتر تکرارهای یک جایگاه ژنی ریزماهواره یکسان است، ولی تعداد واحدهای تکراری در یک جایگاه ژنی ممکن است متفاوت باشد. از این رو آلل های با اندازه های متفاوت به وجود می آیند. درحقیقت در روش STMS جایگاه های ژنی ریزماهواره ابتدا با روش PCR تکثیر و سپس به وسیله الکتروفورز تجزیه می شوند.
- برای تهیه آغازگرهای مکمل نواحی مجاور ریز ماهواره ها، همسانه کردن و ردیف یابی ضروری است که این مورد بسیار هزینه بر و پرزحمت است. ولی پس از طراحی آغازگرها هزینه های بعدی بسیار کم خواهد شد. در روش STMS تفاوت های مشاهده شده در الکتروفورز به دلیل تفاوت در تعداد واحدهای تکرار شونده است. از این رو گفته می شود که این روش به صورت درون جایگاه ژنی عمل می کند و تفاوتهای مشاهده شده بیانگر آلل های متفاوت یک جایگاه ژنی است. برای شناسایی این تفاوت ها باید از ژل هایی با قدرت وضوح زیاد، مانند ژل پلی اکریلامید استفاده کرد.
- آلل های ریزماهواره ای که به وسیله PCR تکثیر می شوند، با استفاده از روش های مختلف نشاندار کردن فلورسنت، رنگ آمیزی نقره یا رنگ آمیزی فلورسنت قابل مشاهده خواهند بود.
ریزماهواره های نشانمند از ردیف یا STMS
مراحل جداسازی و طراحی ریزماهواره های نشانمند از ردیف یا STMS
امروزه در بیشتر موجودات زنده از نشانگرهای STMS استفاده می شود که لازمه آن طراحی آغازگرهای مجاور ناحیه تکرار شونده است. مراحل جداسازی و طراحی این آغازگرها به صورت زیر است:
- جداسازی DNA ژنومی موجود؛
- برش DNA با آنزیم های محدودگر (عمدتا آنزیم های که ردیف های چهار نوکلئوتیدی را شناسایی می کنند)؛
- انجام الکتروفورز ژل آگاروز و جداسازی قطعه های مورد نظر
- اتصال DNA به ناقل مناسب و انتقال آن به E.coli. باید توجه داشت که قطعه های DNA جاگذاری شده کوچک تر به دو دلیل نسبت به قطعه های بزرگ تر بهترند. نخست اینکه ریزماهواره های بسیار طویل در E.coli پایدار نیستند. دوم اینکه همسانه های مثبت انتخاب شده بدون نیاز به ریز همسانه کردن قابل ردیف یابی اند.
- غربال ریزماهواره ها از راه دورگ گیری همسانه یا پلاک یا کاوشگرهای نشاندار؛
- انتخاب همسانه های مثبت و ردیف یابی نواحی اضافه شده (DNA اضافه شده)؛
- طراحی آغازگرهای مناسب مجارو تکرارهای ریزماهواره ای
کاربرد و مزایای نشانگرهای STMS
نشانگرهای STMS، مخصوص یک جایگاه ژنی هستند و به صورت همبارز توارث می یابند. این نشانگرها علاوه بر تنوع آللی زیادی که نشان می دهند، در کل ژنوم نیز پراکنده شده اند. اگرچه هزینه استفاده از این نوع نشانگرها تا حدودی زیاد است، ولی به دلیل پتانسیل زیاد آنها در تشخیص چند شکلی و ناخالصی در یک گونه، به فراوانی استفاده می شوند. قدرت این نشانگرها در شناسایی چند شکلی ها در حدی است که کرگن و همکاران (۱۹۹۵) شناسایی ۲۶ آلل در یک جایگاه ژنی سویا توسط این نشانگرها را گزارش کردند. از آنجا که جایگاه ژنی یک ریزماهواره خاص ژنوم بوده و ردیف های مجاور آن در گونه های خویشاوند حفظ شده است، آغازگر طراحی شده برای یک گونه می تواند به خوبی برای تکثیر ریزماهواره گونه خویشاوند استفاده شود.
در نشانگرهای SSR نیز مانند نشانگرهای AFLP می توان از فرآیند چند ترکیبی بهره گرفت. چند ترکیبی شامل ترکیب قطعه های آللی بیش از یک جایگاه ژنی در یک چاهک الکتروفورز است. به کمک چند ترکیبی می توان تکثیر همزمان جایگاه های ژنی چندگانه در یک PCR را انجام داد. بدین ترتیب مقدار اطلاعات به دست آمده از یک نمونه) افزایش می یابد. همچنین با استفاده از سیستم آشکار کننده چند رنگی فلورسنت سیستم های ABI prism و فرایند چند ترکیبی، می توان در تکثیر همزمان جایگاه های ژنی همپوشان استفاده کرد. در کل نشانگرهای STMS به دلیل اختصاصی بودن، همبارزی و امکان شناسایی آلل ها، نشانگرهای بسیار مناسبی اند.
معایب ریزماهواره های STMS
با وجود چنین مزیت هایی، این نشانگر معایبی نیز دارد:
- مهم ترین عیبش این است که به همسانه سازی و ردیف یابی برای طراحی آغازگر نیاز دارد. از این رو بسیار هزینه بر و پرزحمت است.
- مشکل دیگر این نشانگر روش تعیین ژنوتیپ آن است. دستورکارهای معمولی، استفاده از رادیوایزوتوپ ها و ژل های پلی اکریلامید را برای آشکارسازی ریزماهواره های تکثیر شده توصیه می کنند. در حالی که در بسیاری از موارد اختلاف در اندازه آلل ها طوری است که به راحتی قابل آشکارسازی در ژل آگاروز با استفاده از رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید هستند. البته در استفاده از ژل های پلی آکریلامید غیر واسرشته ساز، با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید یا رنگ آمیزی نقره نیز بدون استفاده از مواد پرتوزا می توان وضوح زیادی را بدست آورد. همچنین امروزه در آزمایشگاه های مجهز از آغازگرهای نشاندار (در ردیف یاب های نیمه خودکار)، برای شناسایی چند شکلی استفاده می شود.
- مشکل دیگر STMS مشاهده باندهای استاتر است که بیشتر در ریزماهواره های دو نوکلئوتیدی به صورت گروهی از باندهای سایه دار (با فاصله دو جفت باز از همدیگر) مشاهده می شوند.
منبع : کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران
دیدگاهتان را بنویسید