مراحل تکنیک مولکولی ریز آرایه
۱- جداسازی و نشاندار کردن RNA برای تجزیه بیان ژن
آر.ان.ا را می توان از نمونه های سلولی یا بافتی به کمک روش های معمول استخراج کرد. کیت های تجاری زیادی برای این منظور وجود دارند. RNA کل و یا mRNA را می توان برای نشاندار کردن استفاده کرد، اما آلودگی های مربوط به دی.ان.ای ژنومی را باید به روش تیمار کردن نمونه با DNase حذف کرد. مقدار آر.ان.ای کل مورد نیاز برای انجام عمل نشاندار کردن در حدود ۲۰ میکروگرم، در حالی که مقدار mRNA مورد نیاز در حدود ۰/۵ میکروگرم است. از مقادیر کمتری نیز می توان استفاده کرد، اما نیاز به خلوص بالا و پروتکل های کاملا بهینه شده دارند. بنابراین اگر چه مقدار RNA می تواند متغیر باشد، اما خلوص و یکپارچگی RNA یک ضرورت است. بهتر است قبل از استفاده از نمونه های RNA در ریز آرایه، کیفیت و کمیت آنها را بررسی کرد. در واقع در بسیاری از آزمایش های ریزآرایه این مرحله خیلی مهم است. این کار را می توان با بررسی میزان جذب در طول موج ۲۶۰ نانومتر نسبت به میزان جذب در ۲۸۰ نانومتر یا الکتروفورز کردن روی ژل آگاروز که با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی میشود، انجام داد.
نشاندار کردن مستقیم RNA با تولید cDNA از RNA توسط آنزیم رونوشت بردار معکوس و قرار دادن نشانه های فلورسنت در آزمایش، که معمول ترین آنها cy3 و cy5 است، انجام می شود. فلورفورهای دیگری نیز در دسترس هستند (مثل cy3 ،Texas Red ،TANMRO) اما هنوز از آنها استفاده زیادی نشده است. در روش غیر مستقیم ابتدا یک گروه فعال که معمولا یک آمین اولیه است، در cDNA قرار می گیرد و سپس در آزمایشی جداگانه ۹۳ یا ۹۵ به آن متصل می شود. مزیت استفاده از روش غیر مستقیم بالاتر بودن کارایی نشاندار کردن است زیرا یک مولکول کوچکتر در حین رونوشت برداری معکوس بهتر در DNA درج میشود. پس از این که کاوشگرهای نشاندار شده با مواد فلورسنت ساخته شدند، باید نوکلئوتیدهای آزادی که در واکنش مصرف نشده اند، حذف شوند. این کار را می توان با کروماتوگرافی ستونی یا رسوب دادن نمونه در اتانول انجام داد. در بعضی از پروتکل ها از هر دو روش به منظور خالص سازی بیشتر استفاده می شود. البته ناگفته نماند که می توان از مواد رادیواکتیو نیز استفاده کرد. نوکلئوتیدهای نشاندار شده با ۳۳ یا s۳۵ علاوه بر اینکه با سرعت بالاتری در cDNA درج می شوند، حساسیت بیشتری نیز به مواد فلورستنی دارند. از این ویژگی ها در ریزآرایه های خاصی استفاده شده که دارای همان تراکم و اندازه ریزآرایه های معمولی هستند، اما نیاز به ابزارهای جانبی کمتر داشته و مجددا قابل استفاده هستند.
۲- دو رگ گیری روی آرایه
شرایط مورد نیاز برای انجام عمل دو رگ گیری دی.ان.اهای نشاندار شده با مواد فلورسنت بر روی ریز آرایه خیلی مشابه با عمل دور گگیری در دیگر روش های زیست شناسی مولکولی است. معمولا محلول دو رگ گیری شامل نمک سیترات سدیم استاندارد (SSC) به عنوان بافر، یک دترژنت مثل SDS و DNA یا RNA غیر اختصاصی مانند RNA ناقل مخمر، DNA اسپرم ماهی و یا DNA تکراری مانند ۱-human Cot است. دیگر واکنش دهنده های متوقف کننده مورد استفاده در واکنش های دو رگ گیری شامل آلبومین سرم گاو و یا واکنش دهنده Denhardt هستند. در نهایت در محلول دو رگ گیری، cDNAهای نشاندار شده که از جمعیت های مختلف آران. تهیه شده اند، قرار می گیرند و درجه حرارت دو رگ گیری برای بافرهای مختلف متفاوت است. اما تقریبا در دمای ۱۵ الی ۲۰ درجه پایین تر از دمای جدا شدن دو رشته مکمل انجام می شود که این دما برای محصولات PCR در سیترات سدیم استاندارد ۴ برابر ۴۵-۴۲ درجه و برای الیگونوکلئوتیدهای طویل ۵۰-۴۲ درجه است. حجم دورگ گیری از ۲۰ میکرولیتر تا چندین میلی متر متغیر است. برای حجم های کم دو رگ گیری، از روکش های آبگریز استفاده می شود. برای حجم های بیشتر می توان از محفظه های دو رگ گیری استفاده کرد.
استفاده از محفظه های دو رگ گیری برای ثابت نگه داشتن دمای مناسب دو رگ گیری و جلوگیری از تبخیر محلول ضروری است. محفظه های دو رگ گیری می توانند از وسایل خودکار با فن آوری پیشرفته و گران تشکیل شده باشند و یا این که می توانند جعبه های خالی پیپت باشند که چند حوله کاغذی مرطوب در آنها جاسازی شده است. میزان محلول مورد استفاده برای فراهم کردن محیطی مرطوب و با دمای ثابت برای اسلاید میکروسکوپی هر مقداری می تواند باشد. بعضی محققین ممکن است حتی از سونا به عنوان محفظه دو رگ گیری استفاده کنند. در حجم های پایین، سرعت دو رگ گیری بالاست و تنها چند ساعت کافی است تا نتایج قابل قبول و تکرار پذیری حاصل شوند، اگر چه انجام دو رگ گیری به مدت یک شب معمول است. پس از دو رگ گیری، ریز آرایه ها به مدت چند دقیقه در محلول های بافری که نمک آنها مرتبا کاهش می یابد شسته شده و سپس خشک می شوند. عمل خشک کردن یا توسط سانتریفیوژ کردن و یا قرار دادن اسلایدها در ایزوپروپانول و سپس خشک کردن سریع آنها توسط گاز نیتروژن یا هوای تمیز انجام می شود.
۳ – مشاهده سیگنال ها
ریز آرایه های نشاندار شده با مواد فلورسنت را می توان توسط اسکنرهای تجاری اسکن کرد. در واقع بسیاری از اسکنرهای ریز آرایه میکروسکوپ های هم کانون اسکن کننده هستند که از لیزر در دو طول موج مخصوص دو رنگ cy3 و cy5 استفاده می کنند. این دو رنگ از رنگ های عمده مورد استفاده در آزمایش ها هستند. اسکنرها، رنگ های فلورسنت موجود در هر نقطه روی ریزآرایه را تحریک می کنند که باعث می شود رنگ مذکور از خود نوری با طول موج مشخص منتشر کند. این نور توسط تیوپ فتو مالتی پلایر دریافت می شود. میزان سیگنال منتشر شده از هر نقطه، رابطه مستقیمی با مقدار رنگ در هر نقطه بر روی ریزآرایه دارد که این مقادیر توسط اسکنر دریافت و اندازه گیری می شوند. تراکم سیگنال ها در هر نقطه را می توان به صورت ترکیبی (هر دو نوع سیگنال) نیز اندازه گیری کرد. برای ریزآرایه های cDNA دو اندازه گیری یکی برای Cy3 و دیگری برای کلات در هر نقطه انجام می شود. بنابراین در ریزآرایه cDNA آنها داده هایی شامل دو عدد بدست می آیند که معادل میزان سیگنال دو رنگ برای آن نقطه هستند. در تراشه های آفی متریکس برای هر نقطه یک عدد بدست می آید، زیرا تنها یک نمونه mRNA برای هر تراشه در دورگ گیری شرکت می کند. زمانی که هر دو رنگ با همدیگر در نظر گرفته می شوند تصویر مرکبی حاصل می شود. این تصویر همان عکس های منحصر به فرد ریز آرایه است.
۴ – تجزیه داده های ریز آرایه
نرم افزار پردازش تصویر که با تجهیزات آرایه DNA همراه است تک تک نقاط روی آرایه را شناسایی کرده و تراکم سیگنال ها را در آنها اندازه گیری می کند. قبل از تجزیه داده ها ابتدا اطلاعات مربوط به شدت سیگنال ها ایجاد شده برای هر نقطه در سطح آرایه نرمال گردیده و سپس بسته به نوع و هدف آزمایش روش های آماری متنوعی از قبیل آزمون، تجزیه کلاستر تجزیه به مولفه های اصلی و آزمون شبکه های عصبی برای تجزیه داده های ریز آرایه استفاده می شود. برای این منظور نرم افزارهای زیادی نیز در دسترس می باشد.
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.
دیدگاهتان را بنویسید