تکنیک Nested PCR

تکنیک Nested PCR: در PCR تک سلولی برای بدست آوردن محصولات قابل تشخیص از توالی‌های منحصر به فرد با استفاده از یک سیستم تشخیصی بر مبنای اتیدیوم بروماید، حدود ۵۰ تا ۶۰ چرخه مورد نیاز است. به دلیل اینکه آنزیم Taq پلیمراز تقریبا پس از ۴۰ چرخه اشتباهاتی را به درون محصول PCR وارد می‌کند. پس از چنین تعداد چرخه بالا که برای PCR تک سلولی مورد نیاز است، محصولات غیر اختصاصی ایجاد می‌شود. این مشکل باعث ایجاد روش Nested PCR شد.

در مرحله اول تکنیک Nested PCR محصولاتی تولید می‌کند که دربرگیرنده محل جهش هستند. اما میزان آن‌ها به اندازه‌ای که قابل رویت باشد نیست. محصولات بدست آمده از واکنش اول به یک لوله جدید منتقل شده و با استفاده از یک سری جدید پرایمر به منظور رسیدن به یک میزان قابل تشخیص تکثیر می‌شوند. پرایمرهای مرحله دوم نسبت به مرحله اول درونی‌تر هستند اما همچنان دربرگیرنده محل جهش می‌باشند. این راه حل علاوه بر اینکه اختصاصیت محصول PCR را افزایش می‌دهد، خطر آلودگی با محصولات PCR قبلی را نیز کاهش می دهد.

Nested-PCR

هدف استفاده از تکنیک Nested PCR

واکنش Nested PCR در شرایطی مورد استفاده قرار می‌گیرد که افزایش حساسیت و یا ویژگی PCR ضروری است. به عنوان مثال هنگام تکثیر ژنی خاص از یک خانواده ژن چند شکلی یا هنگام تکثیر یک نسخه cDNA از mRNA موجود با فراوانی بسیار کم در یک نمونه بالینی حاوی جمعیت ناهمگن از انواع سلول. این روش نیز در تعیین جنسیت جنین در سه ماهه اول بارداری استفاده شده و از این طریق توانسته‌اند بیماری‌های وابسته به جنس را تعیین کرده و از تولد کودکان بیمار جلوگیری کنند.

مراحل واکنش Nested PCR

Nested PCR معمولاً شامل دو واکنش تکثیر پی در پی است که در هر کدام از آن‌ها از یک جفت آغازگر متفاوت استفاده می‌شود. محصول اولین واکنش تکثیر به عنوان الگویی برای PCR دوم استفاده می‌شود که توسط الیگونوکلئوتیدهایی که درون جفت آغازگر اول قرار می‌گیرند، آغاز می‌شود. استفاده از دو جفت الیگونوکلئوتید اجازه می‌دهد تا تعداد بیشتری چرخه انجام شود، در نتیجه حساسیت PCR افزایش می‌یابد.

ویژگی بهبود یافته این واکنش از اتصال دو مجموعه جداگانه آغازگر به همان الگوی هدف ناشی می‌شود. Nested PCR یک روش کارآمد برای تکثیر بخش‌هایی از الگوهای طولانی است، اما نیاز به آگاهی از توالی هدف دارد. این شامل گرفتن مقدار کمی از محصول از RT-PCR اولیه و استفاده از آن به عنوان الگویی برای دور ثانویه تکثیر PCR است.

برای جلوگیری از تکثیر بیشتر پرایمر-دایمرها، آغازگر یا محصولات غیر اختصاصی تولید شده در PCR اولیه، مجموعه دیگری از آغازگرها در PCR ثانویه استفاده می‌شود. این آغازگرها با آغازگرهای مورد استفاده در PCR اولیه، داخلی هستند و یک آمپلیکون تا حدودی کوتاه‌تر ارائه می‌دهند. از آنجا که توالی آن‌ها با مجموعه اولیه آغازگرها متفاوت است، آرتی فکت‌ها یا محصولات غیر اختصاصی تولید شده در PCR اولیه را تکثیر نمی‌کنند، و این امکان را می‌دهد که ویژگی محصول در تعداد زیاد چرخه‌های تکثیر شده در PCR اولیه و ثانویه حفظ شود.

مراحل-واکنش-Nested PCR

معایب

از معایب این روش باقی ماندن در هر دو مرحله اول و دوم است. همچنین در مواقعی که DNA هدف در نمونه مورد آزمایش کم باشد برای جلوگیری ار بالا بردن مقدار DNA و مهار واکنش از این روش استفاده می‌شود.