تعیین حد آستانه در Real-time PCR
برای تعیین حد آستانه در Real-time PCR، سطح سیگنال فلورسنتی را که به اندازه کافی بالای زمینه است و می‌توان آن را یک سیگنال معتبر در نظر گرفت، مشخص می‌کند. چرخه‌ای که در آن به آستانه می‌رسیم یا از آن می‌گذریم، چرخه آستانه (CT) گفته می‌شود و برای مقایسه بین نمونه‌ها استفاده می‌شود. برای تنظیم آستانه باید محدودیت‌های تشخیصی دستگاه و فلورسنس زمینه مواد و فلورسنس استفاده‌شده را در نظر داشت.
پایین قرار دادن آستانه ممکن است به دلیل تفاوت‌های تصادفی در تیوب‌های نمونه باشد و به دلیل تشخیص زودهنگام محصول، باعث جمع‌آوری داده‌های غیرقابل‌اعتماد شود. بالا قرار دادن آن ممکن است باعث تشخیص محصول بعد از اینکه از فاز نمایی گذشته و وارد فاز خطی شده، بشود و باعث جمع‌آوری داده‌های نادرست شود.
تعیین حد آستانه در Real-time PCR
تنظیم مقدار آستانه در در Real-time PCR
برای تنظیم مقدار آستانه، باید میزان خط پایه (Baseline) را تعیین کرد. مقدار خط پایه معمولاً از رسم فلورسنس در برابر تعداد چرخه بدست می‌آید. در طی چرخه‌های ابتدایی، مقدار محصول، معمولاً قابل تشخیص نیست و فلورسنس حول‌وحوش مقداری نوسان می‌کند. که بستگی به مقدار ماده فلورسنت موجود، نوع تیوب‌های استفاده‌شده و عوامل دیگر دارد. یکسری از این داده‌های ابتدایی معمولاً بین چرخه‌های ۳ تا ۱۵، انتخاب می‌شوند تا به‌عنوان پایه برای محاسبه خط پایه استفاده شوند. ازاین‌رو داده‌های اولیه میانگین گرفته می‌شود تا مقدار میانگین خط پایه بدست آید. که اغلب به‌صورت خط راست در سراسر جهت واکنش نشان داده می‌شود.
مقدار CT
به‌طور شاخص، مقدار آستانه با سه انحراف معیار در بالای مقدار خط پایه قرار داده می‌شود. مهم است که آستانه مشخص شود. تا امکان تشخیص محصول در زمانی که هنوز در مرحله فاز نمایی است میسر شود. نقطه‌ای که در آن فلورسنس آستانه را قطع می‌کند، مقدار CT گفته می‌شود.
تعیین-آستانه-RealtimePCR
اهمیت مقدار آستانه در این است که میزان مفیدی را برای مقایسه بین نمونه‌ها بدست می‌دهد. در یک PCR با بازده ۱۰۰ درصد، محصول تکثیرشده در هر چرخه دو برابر می‌شود. این به این معنی است که تفاوت CT بین نمونه‌های مختلف با تفاوت‌های مقدار اولیه توالی هدف مطابقت دارد. برای نمونه، تفاوت ۱ در CT، با تفاوت دو برابری در ماده اولیه مطابقت دارد. و نمونه با مقدار CT پایین‌تر مقدار ماده اولیه بیشتری دارد. هر تفاوت در مقدار CT با تفاوت در ماده اولیه مطابقت دارد. یعنی ۲ به توان تفاوت در CT.
تفاوت در مقدار هدف اولیه= (CT1– CT2)۲
در معادله بالا، CT1، به مقدار CT برای نمونه ۱ و CT2 به مقدار CT برای نمونه ۲ برمی‌گردد. بنابراین، تفاوت در CT به میزان ۴، برابر با ۲۴ یا ۱۶ برابر اختلاف در مقدار اولیه توالی هدف است. به هر صورت، مهم است که دو نمونه که باهم مقایسه می‌شوند، بازده‌های تکثیر مشابهی داشته باشند تا مقایسه اعتبار داشته باشد.
دیدگاهتان را بنویسید