Real-Time PCR با رنگ‌های فلورسنت
تشخیص محصول PCR در زمان وقعی نیاز به استفاده از رنگ‌های فلورسنت دارد. رنگ‌های فلورسنت در تکنیک Real-Time PCR می‌تواند غیراختصاصی باشد. مانند رنگ‌های فلورسنتی که به DNA متصل می‌شوند مانند سایبر گرین I. و یا کاوشگرهای ویژه رشته باشند، همانند بیکون‌های مولکولی (Beacons) یا تک من (Taq man) که بسیاری از آن‌ها از پدیده‌ای به نام انتقال انرژی رزونانس فلورسنت (Fluorescent resonance energy transferd) برای تمایز بین محصولات مختلف استفاده می‌کنند.
Real-Time PCR با رنگ های فلورسنت غیراختصاصی
برای بهینه‌سازی اولیه تکثیر در تکنیک Real-Time PCR، رنگ‌های فلورسنت غیراختصاصی از خانواده سایبر گرین بیشتر از بقیه استفاده می‌شوند. زیرا نسبت به کاوشگرهای ویژه رشته اقتصادی‌تر بوده و راحت‌تر بهینه‌سازی می‌شوند. زمانیکه از این روش تشخیص استفاده می‌شود، در طی تکثیر PCR، یک قطعه DNA ی ویژه تکی باید بدست آید. زیرا افزوده شدن هر قطعه DNA غیراختصاصی در فلورسنس اندازه‌گیری شده، سهم خواهد داشت. اگر باندهای غیراختصاصی در واکنش PCR تکثیر می‌شوند و یا اگر تکثیر بیش از یک توالی هدف در یک واکنش PCR تکی رصد می‌شود، باید کاوشگرهای ویژه رشته طراحی شوند.
انتقال انرژی رزونانس فلورسنت
رنگ های سایبر گرین I و سایبر گرین گلد
درحالی‌که انواع دیگری از کاوشگرهای غیراختصاصی در دسترس‌اند مانند کاوشگرهای مولکولی YoPro و YoYo، استفاده کردن از رنگ‌هایی که به شیار کوچک (Minor grooved) متصل می‌شوند، مانند سایبر گرین I و سایبر گرین گلد (SYBR Gold)، بسیار متداول‌اند.
بازتاب بیشینه برای سایبر گرین I و سایبر گرین گلد با بازتابش فلورسین بسیار نزدیک است، حدود ۵۲۰ نانومتر. و بیشتر ترمال سایکلرهای زمان واقعی optics برای تشخیص در این طول‌موج دارند. طبیعت کلی و هزینه نسبتاً پایین این رنگ ها، آن‌ها را برای بهینه‌سازی دامنه گسترده‌ای از واکنش‌های PCR ایده آل می‌سازد و می‌تواند داده‌های کمی مناسبی برای بسیاری کاربردها ارائه دهد (برای مثال مطالعه بیان ژن). برای بسیاری آزمایش‌ها، مانند تشخیص تنوع آللی روش‌های ویژه رشته توصیه می‌شوند، مانند تک من یا بیکون های مولکولی.
سیستم تشخیص ترمال سایکلر Real-Time PCR
سیستم تشخیص ترمال سایکلر Real-Time PCR، مبتنی بر یک سیستم برانگیختگی و بازتابش است. بسته به نوع شرکت سازنده، منبع نور از زنون، تنگستن هالوژن یا نور LED تشکیل‌شده است. شناساگر یک دوربین CCD (دستگاه خنک‌کننده سرد) یا دستگاه PMT (لوله فتومولتیپر) است.
سیستم تشخیص ترمال سایکلر Real-Time PCR
اصول کار رنگ‌های خانواده سایبرگرین در Real-Time PCR
اصول کار رنگ‌های خانواده سایبرگرین این است که پس از متصل شده به dsDNA، دچار افزایش ۲۰ تا ۱۰۰ برابری فلورسنس می‌شوند که توسط شناساگر دستگاه PCR زمان واقعی شناسایی می‌شود. بنابراین، همچنان که dsDNA در مخلوط واکنش افزایش می‌یابد، افزایش متناظری در سیگنال فلورسنت به وجود خواهد آمد.
در هر حال، این رنگ‌ها بین محصولات مختلف dsDNA تمایزی قائل نمی‌شوند. واکنش‌های PCR باید طوری بهینه‌سازی شوند که تنها آمپلیکون هدف وجود داشته باشد. یا روش‌های دیگر به کار گرفته شوند تا بین محصولات مختلف تمایز قائل شوند. برای نمونه، آنالیز نقطه ذوب.
رنگ‌های خانواده سایبرگرین
کاوشگرهای فلورسنت ویژه رشته
کاوشگرهای اسید هسته‌ای متصل به فلئوروفور را می‌توان به‌عنوان سیستم شناسایی استفاده کرد. این کاوشگرهای فلورسنت ویژه رشته به‌صورت توالی ویژه برهم‌کنش می‌کنند و اطلاعاتی را در مورد یک محصول ویژه PCR که در حال افزایش است، فراهم می‌کند.
کاوشگرهای فلورسنت ویژه رشته
کاوشگرهای Taq Man در Real-Time PCR
کاوشگرهای Taq Man نمونه شناخته‌شده‌ای هستند و در بسیاری پژوهش‌ها استفاده‌شده‌اند. کار آن بر پایه فعالیت ۵ نوکلئازی تک پلی‌مراز است. کاوشگرهای Taq Man الیگونوکلئوتیدهای ویژه توالی هستند، با دو فلئوروفور در دو انتهایشان. یک فلئوروفور فرونشاننده و دیگری گزارشگر نامیده می‌شود.
کاوشگر TaqMan در تکنیک Real-Time PCR، برای تکثیر توالی اختصاصی حاصل از قطعات DNA مورداستفاده قرار می‌گیرد. لیزر گزارشگر فلوروکروم را تحریک می‌کند و سپس نوری که توسط فرونشاننده نزدیک آن جذب‌شده ساطع می‌گردد. بعد از فعالیت ۵ نوکلئاز Taq پلی‌مراز، فرونشاننده دیگر در نزدیکی گزارشگر قرار ندارد و بنابراین نور ساطع‌شده توسط گزارشگر را می‌توان تشخیص داد. (R: گزارش گر؛ Q: فرونشاننده)
زمانیکه فلئوروفور گزارشگر، در طول‌موج مناسبی برانگیخته می‌شود، نور را جذب می‌کند و سپس یک نور با طول‌موج مشخص را بازتاب می‌کند. تا زمانی که فرونشاننده نزدیک آن باشد، نور بازتاب شده را با FRET جذب می‌کند. فرونشاننده‌ها بر پایه توانائی‌شان در جذب ویژه طیف گزارش گر انتخاب می‌شوند و در کاوشگر جا داده می‌شوند تا آن نور را دریافت کنند.
کاوشگرهای Taq Man
روش کار کاوشگر Taq Man در Real-Time PCR
کاوشگر Taq Man طوری طراحی می‌شود که در جایگاهی داخلی به محصول در حال تکثیر شدن متصل شود. به‌طور ویژه انتهای ۳ پریم کاوشگر، برای جلوگیری از طویل سازی رشته توسط کاوشگر متصل شده به رشته بلوکه می‌شود. همچنان که محصول افزایش می‌یابد، آغازگری که دوگانه نشان‌دار شده (Dual-labeled) به‌توالی هدف متصل می‌شود و توسط فعالیت نوکلئاز پلی‌مراز Taq تجزیه می‌شود.
روش کار کاوشگر Taq Man
این حالت نتیجه روبه‌رو شدن آنزیم Taq با کاوشگر در زمان طویل شدن آمپلیمر (Amplimer) رخ می‌دهد. تجزیه شدن فرونشاننده را از گزارشگر دور و توانایی آن را در جذب نور بازتاب شده توسط گزارش گر کم می‌کند. بنابراین افزایش در فلورسنس که مرتبط با تکثیر ویژه توالی هدف است به وجود می آید. این سیگنال تولیدشده حالت تجمعی (Cumulative) دارد. این برخلاف چیزی است که در روش‌های ویژه رشته دیگر دیده می‌شود که مبتنی بر اندازه‌گیری دو رگ گیری مستقیم کاوشگر با هدف در طی هر چرخه هستند.
روش تک من خیلی حساس و وابسته به کاوشگری است که می‌تواند به‌طور کارآمدی هیدرولیز شود. برای اطمینان از شکسته شدن کارآمد، کاوشگر باید Tm به‌اندازه ۵ تا °C10 بیشتر از آمپلیمر داشته باشد تا اتصال آن را به هدف، پیش از طویل شدن تسهیل کند. به هر صورت، تولید چنین کاوشگری می‌تواند در هدف‌های غنی از AT مشکل‌ساز باشد.
مزایای استفاده از کاوشگرهای فلورسنت ویژه رشته در Real-Time PCR
۱- یکی از مزیت‌های سیستم‌های کاوشگری ویژه رشته این است که چندین کاوشگر را می‌توان ترکیب یا multiplexed کرد و بنابراین اطلاعات در مورد چنین توالی هدف را می‌توان از یک واکنش به دست آورد. این حالت می‌تواند خیلی مفید باشد زیرا هم کنترل‌ها و هم توالی‌های هدف در شرایط یکسان تکثیر می‌شوند.
۲- مزیت دوم زمانی است که دو محصول پتانسیل PCR وجود داشته باشند که ممکن است با یک جفت آغازگر تولید شوند. استفاده از کاوشگرهای ویژه رشته می‌تواند برای تشخیص دو محصول استفاده شود. سیستم هیدرولیز کاوشگر و دیگر سیستم‌های کاوشگر ویژه توالی می‌توانند جهش‌های نقطه‌ای، SNP ها و واریانت‌های آللی را که شناسایی آن‌ها به‌آسانی با سایبر گرین I یا سایبرگلد میسر نیست، شناسایی کنند.
منبع:
دیدگاهتان را بنویسید