روش های نشاندار کردن کاوشگر
در توضیح روش های نشاندار کردن کاوشگر، روش‌های متفاوتی برای نشاندار کردن کاوشگر وجود دارد که به حساسیت مورد نیاز برای آشکارسازی قطعه‌های دورگ گیری شده بستگی دارد. مواد پرتوزا مانند ۳۰S و ۳۳ و ۳۳۲ اولین گروه موادی بودند که برای نشاندار کردن مورد استفاده قرار گرفتند. اما به دلیل اینکه کار با مواد پرتوزا شرایط ویژه‌ای دارد، برخی از پژوهشگران به استفاده از روش‌های جایگزین مانند استفاده از بیوتین، دیگوکسی ژنین و فلورسین روی آورند.
روش های عمده تهیه کاوشگر نشاندار عبارتند از:
۱ – روش ترجمه بریدگی
در این روش ابتدا DNA به کمک آنزیم DNase II شکاف داده می شود. این آنزیم به طور تصادفی شکاف های تک رشته ای را در DNA را ایجاد می کند. سپس DNA شکافته شده با آنزیم DNA پلیمراز I تیمار می شود. این آنزیم که به طور طبیعی در ترمیم خسارت DNA شرکت دارد از قدرت حذف نوکلئوتیدها و سپس پلیمریزاسیون آنها برخوردار است.
بنابراین به کمک این آنزیم، مولکول DNA از محل شکاف همانندسازی می‌شود. در مخزن نوکلئوتیدی مورد استفاده این آنزیم، یک یا دو نوع نوکلئوتید نشاندار قرار داده می‌شود. بدین ترتیب در درون مولکول DNA ساخته شده قرار می‌گیرد. نوکلئوتیدها را می‌توان با استفاده از رادیوایزوتوپ‌ها یا از طریق بیوتین، دیگوکسی جنین و فلوروسین نشاندار کرد.
روش ترجمه بریدگی کاوشگر
۲ – استفاده از آغازگر های تصادفی
روش اتصال تصادفی آغازگر نیز مانند روش ترجمه بریدگی، کاوشگرهای DNA تک رشته‌ای را ایجاد می‌کند. ابتدا DNA واسرشته شده و سپس گروهی از هگزامرها به عنوان آغازگرها به DNA کاوشگر متصل می‌شود. هگزامرها دارای همه انواع ممکن از ترتیب قرار گرفتن چهار نوع نوکلئوتید هستند. DNA پلیمراز امکان ایجاد رشته‌های جدید از آغازگرها را فراهم می سازد و بدین طریق نوکلئوتیدهای نشاندار در رشته جدید ساخته شده قرار می‌گیرند.
از آنجا که ردیف آغازگرها تصادفی است، بنابراین امکان داشتن هر نوع ردیف در کاوشگرهای نشاندار وجود خواهد داشت. اگر به جای DNA پلیمراز از آنزیم رونوشت بردار معکوس استفاده شود، می‌توان کاوشگر مکمل مولکول mRNA آنها را نیز ایجاد کرد. کاوشگر حاصل دو رشته‌ای خواهد بود که می‌توان آن را با استفاده از سود سوزآور با حرارت تک رشته‌ای نمود.
۳ – نشاندار کردن کاوشگر با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز
نشاندار کردن کاوشگر با استفاده از PCR، کاوشگرهای نشاندار دو رشته ای را به وجود می آورد که می توان با استفاده از حرارت آنها را تک رشته‌ای کرد. از مزیت‌های این روش این است که نسبت به روش‌های دیگر به DNA کمتری نیاز دارد. از طرف دیگر محصولات ایجاد شده همگی دارای طول یکسان هستند و مقدار کاوشگر نشاندار بدست آمده نیز بیشتر از سایر روش‌ها خواهد بود. در این روش می‌توان یکی از نوکلئوتیدهای موجود در ترکیب واکنش زنجیره‌ای پلیمراز را از نوع پرتوزای آن انتخاب و در محلول واکنش قرار داد. به این ترتیب همه رشته‌های تکثیر شده نشاندار خواهند بود.
نشاندار کردن کاوشگر با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز
۴ – روش نشاندار کردن انتهایی
به دلیل طبیعت موازی بودن دو رشته DNA، در یک انتهای مولکول یک رشته دارای انتهای ۵ پریم PO4 و رشته دیگر دارای انتهای ۳ پریم OH است. به کمک آنزیم‌ها می‌توان این انتهاها را نشاندار کرد. بنابراین روش نشاندار کردن انتهایی به دو صورت است:
الف – نشاندار کردن انتهای ‘۵
شامل استفاده از آنزیم پلی نوکلئوتید کیناز T۴ است، تا به کمک این آنزیم انتهای غیر ایزوتوپی PO4 با ایزوتوپ PO4 نشاندار گردد. برای این منظور ابتدا در گام اول به کمک آنزیم الکالین فسفاتاز، ۵ پریم PO4 غیر ایزوتوپی حذف می‌گردد. سپس به کمک آنزیم پلی نوکلئوتید کیناز، ایزوتوپ MO4 جایگزین می‌شود. این مورد برای کاوشگر‌هایی با طول زیاد کارایی کمی دارد.
ب – نشاندار کردن انتهای ‘۳
نشاندار کردن انتهای ‘۳ به دو طریق امکان‌پذیر است. در روش اول به کمک آنزیم ترمینال داکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز می توان چندین نوکلئوتید را به انتهای ۳ پریم OH اضافه کرد. در روش دوم کاوشگر DNA را می‌توان با یک آنزیم برشی مناسب برش داده و سپس به کمک قطعه کلنو آنزیم DNA پلیمراز، انتهای ۳ پریم OH برش داده شده را با نوکلئوتیدهای نشاندار پر و انتهای صاف ایجاد کرد.
۵ – نشاندار کردن مستقیم
این روش شامل استفاده از عامل اتصال دهنده گلوتارآلدئید برای اتصال مستقیم پراکسیداز و یا آلکالین فسفاتاز به DNA است. این روش نسبت به روش‌های قبلی سریعتر است
مزایای کاوشگرهای RNA
۱- کاوشگرهای RNA تک رشته‌ای هستند، بنابراین قبل از استفاده نیازی به واسرشته‌سازی ندارند. از آنجا که کاوشگرهای RNA قابل اتصال به یکدیگر نیستند، از این رو تمامی مولکول‌های کاوشگرهای RNA را برای شناسایی ردیف مورد جستجو در دسترس خواهند بود.
۲- کاوشگرهای RNA از پایداری حرارتی زیادی برخوردارند و مانند کاوشگرهای DNA ایجاد شده از روش نشاندار کردن PCR، از طول یکسان برخوردارند و به طور پیوسته نشاندار شده اند.
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.
دیدگاهتان را بنویسید