تکنولوژی Real-Time PCR

تکنولوژی Real-Time PCR یک تغییر اخیر در PCR است که به‌ سرعت در حال تغییر دادن طبیعت نحوه انجام پژوهش در علوم بیومدیکال است. این روش ابتدا در سال ۱۹۹۲ توسط هیگوچی و همکاران معرفی شد و از آن زمان گسترش پیداکرده است. PCR زمان واقعی امکان تعیین کمیت دقیق اسیدهای هسته‌ای ویژه‌ای را در یک مخلوط کمپلکس میسر می‌کند. حتی اگر مقدار ماده اولیه غلظت خیلی کم داشته باشد. این کار با رصد کردن تکثیر توالی هدف در زمان واقعی با فناوری فلورسنت انجام می‌شود. سرعت رسیدن توالی هدف به سطح آستانه تشخیص (Threshold detection level) با مقدار ماده اولیه موجود رابطه دارد.

کاربرد تکنولوژی Real-Time PCR

در دهه گذشته تکثیر توسط PCR زمان واقعی به ابزار استفاده گسترده‌ای برای تعیین کمیت توالی‌های ویژه در مخلوط‌های پیچیده دارد. برای نمونه PCR زمان واقعی برای تعیین:

ژنوتیپ،
تعیین مقدار بار ویروسی در بیماران
و ارزیابی تعداد نسخه ژن در بافت سرطانی استفاده‌ شده است.

در هرحال استفاده عمومی این فناوری مطالعه سطح بیان ژن با همراه کردن آن با روشی به نام ترانسکریپتاز معکوس است. با ترکیب کردن دو فناوری می‌توان سطح رونوشت RNA را به‌صورت کمّی اندازه‌گیری کرد. PCR در زمان واقعی می‌تواند محصول آمپلیکون را در فاز نمایی واکنش PCR با استفاده از فناوری مبتنی بر فلورسنت اندازه‌گیری کند. که این برخلاف اندازه‌گیری مقدار محصول در واکنش نقطه پایانی است. آمپلیکون در زمان واقعی یا همچنان که ساخته می‌شود، با نشان‌دار کردن و شناسایی محصول در حال ساخته‌شدن با سوبسترایی که به‌صورت فلورسنت دنباله‌دار شده در طی مراحل تکثیر، رصد می‌شود.

مزیت تکنیک Real-Time PCR نسبت به PCR معمولی

این روش نسبت به PCR معمولی چندین مزیت دارد:

افزایش سرعت به دلیل کاهش تعداد چرخه‌ها،
نبود تشخیص پس از PCR با الکتروفورز روی ژل
و حساسیت بیشتر رنگ‌های فلورسنت برای تشخیص آمپلیکون است.

مراحل تکنیک Real-Time PCR

۱- خالص‌سازی RNA باکیفیت بالا

مهم‌ترین مرحله برای در نظر داشتن در تولید داده‌های مفید با PCR در زمان واقعی، کیفیت RNA استخراج‌شده است. RNA پایداری کمتری نسبت به DNA دارد و آن به دلیل طبیعت و در همه‌جا بودن و پایداری RNases نسبت به DNases هاست. بعلاوه، از نظر شیمیایی RNA نسبت به DNA کمتر پایدار است و حتی وقتی RNA بسیار خالص باشد، نسبت به تجزیه خود به خوی در محلول حساس‌تر است.

بنابراین، اهمیت دارد که نمونه‌های RNA را با سرعت پایدار کنید. به‌طور شاخص می‌توان RNA را با افزودن بازدارنده‌های RNases ها مثل RNasin و diethylpyrocarbonate و با نگهداری در ۷۰ درجه سانتیگراد پایدار کرد. بعلاوه، آلودگی DNA می‌تواند مشکل عمده‌ای باشد. بنابراین مراحلی را باید در نظر گرفت تا این احتمال را کاهش داد. راحت‌ترین روش برای کاهش آلودگی DNA، تیمار کردن نمونه‌های RNA با RNase بدون DNase است که از چندین سازنده در دسترس‌اند.

استخراج RNA کل از بافت‌

روش‌های زیادی برای استخراج RNA ی کل از بافت‌های مختلف وجود دارد. و روش‌های ویژه‌ای برای بافت‌های موردمطالعه باید استفاده شود. اگر در دسترس باشند. وقتی‌که روش‌های استخراج RNA یی را انتخاب می‌کنید، باید تصمیم بگیرید که از RNA پیامبر (mRNA) یا RNA کل به‌عنوان هدف برای سنجش PCR در زمان واقعی استفاده کنید. استخراج mRNA نیاز به مرحله اضافی‌ای دارد که در آن آلوده شدن یا از بین رفتن الگو می‌تواند رخ دهد.

اما اگر الگوی RNA ی هدف در مقادیر خیلی کم باشد، منبع بهتری است. در هر صورت، برای بیشتر هدف‌ها، توصیه می‌شود که با RNA کل کار شود. زیرا خالص‌سازی آن ساده‌تر است. و معمولاً RNA را با مقدار و کیفیت مطلوب برای PCR در زمان واقعی فراهم می‌کند. سازندگان بسیاری وجود دارند که کیت‌های easy-to-use برای استخراج RNA و کنترل کیفی خوب و روش‌های استانداردسازی خالص‌سازی را برای مقایسه بین آزمایشگاه‌ها ارائه می‌دهند. مانند Ambion ،Stratagene ،Qiagen و Invitrogen. سایت اینترنتی Ambion بسیار مفیدی را ارائه می‌دهد (http://www.ambion.com) که زمینه گسترده‌ای را برای کسانی که تازه با RNA کار می‌کنند، دارد.

استخراج-RNA

۲- تبدیل بهینه RNA به cDNA

اولین قدم در واکنش RT-PCR، تبدیل انتخابی مولکول‌های RNA به cDNA است. که با ژن‌های کد کننده پروتئینی مطابقت دارند. RNA ای که توالی پروتئینی را کد می‌کند، RNA پیامبر (mRNA) نامیده می‌شود. و به‌عنوان بخشی از RNA کل از مجموعه‌ای از سلول‌ها یا بافت استخراج و خالص‌سازی می‌شود. از نظر آزمایشگاهی، فرایند ترانسکریپتاز معکوس تنوع زیادی دارد.

اما مرحله اصلی آن تبدیل mRNA به الگوی cDNA در واکنشی است که با آنزیم DNA پلی‌مراز وابسته به RNA به نام ترانسکریپتاز معکوس انجام می‌شود. یک مولکول کوچک DNA به نام آغازگر الیگو داکسی نوکلئوتید با mRNA مکمل دو رگ می‌شود که اجازه دهد آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (RT) آغازگر را امتداد دهد و یک‌رشته DNA مکمل تولید کند.

توالی آغازگر DNA را می‌توان طوری طراحی کرد که به زن هدف ویژه یا تمام mRNA ها در یک نمونه mRNA خالص‌شده متصل شود. یک الیگونوکلئوتید آنتی سنس ساختگی که به‌توالی mRNA ی موردنظر متصل می‌شود، برای تبدیل یک توالی ژن ویژه به cDNA موردنیاز است. یک آغازگر همگانی که قادر به دورگ شدن با هر نسخه‌ای از mRNA است، برای تبدیل mRNA ها به cDNA در یک نمونه معین استفاده می‌شود.

۳- تشخیص محصولات PCR به‌صورت دقیق در زمان واقعی

برای اطمینان حاصل کردن از خالص‌سازی الگو RNA باکیفیت بالا برای ساخت cDNA توصیه می‌شود. که یک کیت خالص‌سازی RNA از یکی از شرکت‌های تجاری خریداری شود تا زمان موردنیاز برای تهیه مواد و تائید آنها، حذف شود. معمولاً تنها هزینه‌های اضافی وقتی‌که با افراد بی‌تجربه کار می‌کنیم لازم می‌شود. برای ساخت cDNA، آنزیم ترانسکریپتاز معکوس با بازه واکنش و دیگر مواد موردنیاز را می‌توان از سازندگان آن‌ها تهیه کرد. معمولاً سازندگان شرایط بهینه‌شده‌ای را برای ساخت کارآمد cDNA ارائه می‌دهند. آنالیز RT-PCR در زمان واقعی نیاز به بهینه‌سازی شرایط واکنش دارد. و پیشنهاد می‌شود که از مواد توصیه‌شده و شرایط سازندگان دستگاه ترمال سایکلر خود استفاده کنید، تا نتیجه قابل‌اعتماد داشته باشید.