تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
PCR

کاهش آلودگی PCR با ۶ روش

  • کاهش آلودگی PCR با ۶ روش

    کاهش آلودگی PCR با ۶ روش: حساسیت تکنیک PCR به دانشمندان این امکان را می دهد تا DNA نمونه های خام را استخراج کرده و پروفایل های مفید DNA را بدست آورند. با این حال، این سطح بالای حساسیت همچنین می تواند مشکلاتی را ایجاد کند. زیرا الگوی اشتباه را می توان تکثیر کرد.

    اگرچه این سطح از حساسیت به نفع آزمایشگاه است. اما اگر مراقبت نشود، این آلودگی به سایر الگوها و آمپلیکون ها (محصول تکثیر شده DNA حاصل از تکثیر قبلی) که ممکن است در محیط آزمایشگاه وجود داشته باشد، می تواند مشکلاتی را ایجاد کند. این مشکلات آلودگی می تواند منجر به تکثیر الگوی اشتباه شود. یعنی نتایج مثبت کاذب. ما در این مطلب قصد داریم ۶ نکته را به شما نشان دهیم که باید در طول پروتکل PCR در نظر بگیرید.

    آلودگی PCR

    کاهش آلودگی PCR با ۶ روش

    ۱- توزیع مکان های آزمایشگاه PCR

    پیشگیری از آلودگی با توزیع مکان های آزمایشگاه PCR آغاز می شود. حداقل، دو مکان برای آزمایش PCR باید تعیین شود: قبل و بعد از PCR. یک اتاق باید به طور خاص برای مرحله قبل از PCR (Pre-PCR) در نظر گرفته شود. در حالت مطلوب، این اتاق باید بیشتر به دو قسمت تقسیم شود:

    ۱- تهیه مخلوط PCR

    ۲- تهیه نمونه علاوه بر ترکیب اصلی

    آماده سازی نمونه ممکن است با استخراج دستی یا خودکار باشد. وسایل مصرفی و تجهیزات کوچک  شامل:

    ۱- مینی سانتریفیوژ

    ۲- دستگاه ورتکس،

    ۳- پیپتور ها

    ۴- تیپ ها و لوله ها

    همانطور که قبلاً ذکر شد، یک اتاق برای مرحله بعد از PCR (Post-PCR) باید جهت مراحل تکثیر و تجزیه و تحلیل ایجاد شود. این اتاق باید از اتاق قبل از PCR جدا شود. اتاق پس از PCR مکانی است که در آن استفاده از سایکلرهای حرارتی برای تکثیر و هر ابزار دقیق دیگری برای تجزیه و تحلیل پس از PCR مورد نیاز است. این اتاق همچنین باید شامل کیت های استخراج و خالص سازی DNA و RNA باشد. در آخر، باید یک یخچال/ فریزر اختصاصی برای ذخیره کیت و دیگری برای ذخیره نمونه ها وجود داشته باشد.

    اتاق قبل از مرحله PCR

    ۲- گردش کار یک طرفه

    گردش کار یک آزمایشگاه مولکولی باید فقط در یک جهت ادامه یابد. یعنی از Pre-PCR به Post-PCR. نمونه ها و معرف های مسترمیکس PCR که ممکن است حاوی الگوهای PCR باشند، باید فقط در اتاق قبل از PCR تهیه شوند. لوله های آزمایشی که در اتاق پس از PCR تحت تکثیر قرار گرفته اند، حاوی آمپلیکون هستند (الگوی تکثیر شده) و هرگز نباید تحت هیچ شرایطی در اتاق قبل از PCR باز یا وارد شوند.

    آمپلیکون ها می توانند به عنوان الگویی برای واکنش های PCR در آینده عمل کنند. بنابراین می توانند PCR یا معرف ها، مواد مصرفی یا تجهیزات را به راحتی آلوده کنند. این بدان معنی است که مواد مصرفی از جمله کیت های آزمایشگاهی، دستکش، عینک و غیره که به اتاق بعد از PCR وارد شده اند، هرگز نباید بدون ضدعفونی کامل در اتاق قبل از PCR قرار گیرند. هنگام جابجایی از یک اتاق به اتاق دیگر، یک متخصص آزمایشگاه باید به یاد داشته باشد که مواد مصرفی را تغییر دهد. در حالت ایده آل، تکنسینی که در Post-PCR کار کرده اند نباید برگردند و در Pre-PCR کار کنند.

    ۳- تکنیک پیپتینگ جهت کاهش آلودگی PCR

    در هر روش مولکولی، نحوه استفاده از پیپت آزمایشگاهی برای عملکرد و کیفیت نتایج شما بسیار مهم است. علاوه بر این، روش صحیح پیپتینگ می تواند آلودگی بین نمونه ها را که می تواند منجر به نتایج مثبت کاذب شود، به حداقل برساند. روش مناسب پیپتینگ تضمین می کند که حجم دقیق توزیع می شود و از پاشیدن هنگام پخش مایعات جلوگیری می کند. تمام تیوب های حاوی نمونه و پلیت های واکنش را با دقت باز و بسته کنید تا نمونه ها پاشیده نشوند. اسپین تیوب های آزمایش و پلیت ها قبل از باز کردن می تواند از ورود آئروسل ها در هنگام باز کردن لوله ها جلوگیری کند.

    روش انجام پیپتینگ

    ۴- تعویض مرتب دستکش

    یک تکنسین آزمایشگاه هنگام کار در منطقه PCR همیشه باید از دستکش تازه استفاده کند. دستکش ها را مرتبا عوض کنید. مخصوصاً اگر مشکوک هستید که آنها با محلول های حاوی DNA الگو آلوده شده اند.

    ۵- تکنیک آسپتیک

    توصیه می شود که برای ضدعفونی صحیح باید به طور دوره ای قبل و بعد از کار PCR انجام شود. این مربوط به تمام سطوح کاری از جمله صندلی های آزمایشگاه، لوله ها و تیوب های آزمایش، دسته های یخچال و فریزر و سایر نقاط لمسی است. توصیه می کنیم این سطوح را با استفاده از ماده سفید کننده ۱۰-۱۵٪ (۰/۵-۱٪ سدیم هیپوکلریت) ضدعفونی  کنید. پس از پانزده دقیقه، از یک حوله کاغذی مرطوب با آب دوبار تقطیر شده برای پاک کردن بقایای سفید کننده استفاده کنید. به دنبال آن می توان یک حوله کاغذی مرطوب با الکل ۷۰ درصد داشت تا به خشک شدن سریع سطوح کمک کند. راه حل دیگر می تواند استفاده از کیت های Minerva Biolabs برای آلودگی زدایی باشد.

    ۶- تیمارهای کنترل را در پروتکل قرار دهید

    یک روش خوب شامل یک کنترل مثبت برای اطمینان از روند استخراج و تکثیر به درستی است. علاوه بر این لازم است که پروتکل کنترل منفی یا کنترل بدون الگو (NTC)، یعنی کنترلی که شامل نمونه نیست، باشد. این کنترل به منظور بررسی عدم وجود آلودگی در معرف ها، مواد مصرفی و محیط کار است.

    کنترل مثبت و منفی در آزمایش PCR

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.