امروزه نشانگرهای مولکولی مختلف به وفور در انسان، گیاه، حیوان و ریزسازواره ها به منظور مطالعات پایه ای و یا کاربردی مورد استفاده قرار می گیرند. این نشانگرها، ویژگی ها، سودمندی و کاربردهای مختلفی دارند که در بسیاری از موارد بین برخی از نشانگرها مشترک است و در برخی موارد، یک نشانگر نسبت به نشانگر دیگر از نظر موارد ذکر شده کارآمدتر می باشد. همچنین هر سیستم نشانگری دارای مزایا و معایبی است که با توجه به این مزایا و معایب باید بهترین سیستم نشانگری انتخاب شود.
خصوصیات نشانگرهای مولکولی:
۱ – فراوانی
تعداد نشانگرهای ایجاد شده به طور عمده تحت تأثیر فراوانی مکان های ژنی مورد نظر در ژنوم است. از آنجا که تعداد زیادی جایگاه برشی اندونوکلئازی در ژنوم وجود دارد، نشانگرهای RFLP و AFLP، نشانگرهایی با قدرت فراوانی زیاد به شمار می آیند، البته در ژنوم یوکاریوت ها ریزماهواره ها نیز به عنوان نشانگرهای با فراوانی زیاد مطرح اند.
همچنین نشانگرهای RAPD نیز به دلیل وجود تعداد زیادی ردیف تصادفی در ژنوم، به عنوان نشانگرهای با فراوانی بسیار زیاد به شمار می آیند. برخلاف این نشانگرها، نشانگرهای آلوزایم به واسطه تعداد اندک سیستم آنزیمی در دسترس، کم شمارند. همچنین به منظور تشخیص جایگاه های خاص ژنوم بوسیله نشانگرهای SSCP ،CAPS ،SCAR و ردیف یاب PCR ردیف جایگاه های هدف (عموما ژن های ساختمانی)، برای ایجاد آغازگر مورد نیاز خواهد بود که فراوانی نشانگر را تحت تأثیر قرار می دهد.
فراوانی نشانگرها برای مطالعاتی که نیاز به بخش بزرگی از ژنوم دارند بسیار با اهمیت است. برای مثال برای تهیه نقشه های پیوستگی با تراکم زیاد فراوانی نشانگر بسیار اساسی است.
۲ – میزان چند شکلی
قدرت نشانگرهای مولکولی معمولا از طریق مقدار چند شکلی ایجاد شده تعیین می شود. این مقدار چند شکلی بیشتر تحت تاثیر مقدار جهش در جایگاه های ژن هدف است. تنوع در جایگاه های ژنی آلوزایم به دلیل جهش نقطه ای با فراوانی کم است. علاوه بر این فقط جهش هایی که بتوانند بار الکتریکی خالص پروتئین ها را تغییر دهند، آشکار می شوند.
این مورد قدرت آلوزایم ها را در ایجاد چند شکلی کاهش می دهد. برخلاف این، جهش های مربوط به جایگاه های ژنی ریز ماهواره ها و ماهوارک ها در هر میوز بسیار زیاد است. بقیه نشانگرها عموما سطوح حدواسط چند شکلی را نشان می دهند. چند شکلی مشاهده شده در این نوع نشانگرها به دلیل جایگزینی، کمبود و ازدیاد باندهاست که ممکن است جایگاه اتصال آغازگرها و جایگاه تشخیص برش توسط آنزیم های محدودگر و یا اندازه قطعه های برشی (و یا قطعه های تکثیر شونده) را تغییر دهند.
در انتخاب نوع نشانگر، برای بدست آوردن چند شکلی کافی، نوع رابطه خویشاوندی و نوع مواد مورد مطالعه اهمیت زیادی دارند. در کل هر چه نمونه های مورد مطالعه به هم نزدیک تر باشند، نشانگرهای با قدرت بیشتر در تشخیص چند شکلی مورد نیاز خواهند بود.
۳ – مکان یابی خاص ژن
در نشانگرهای ژنتیکی از کاوشگرها یا آغازگرهای مربوط به چند مکان ژنی استفاده می شود. از این رو می توان به طور همزمان چندین چند شکلی مختلف (نواحی مختلف ژنوم) را شناسایی کرد. با وجود این اشکال عمده این روش ها این است که الگوهای باندی عموما به صورت جایگاه های ژنی و آلل ها قابل تفسیر نیستند و فقط می توان حضور یا عدم حضور باندها با اندازه خاص) را نمره دهی کرد. از این رو ممکن است قطعه هایی با اندازه های مشابه، آلل های مربوط به جایگاه های ژنی متفاوت با غیر همولوگ را نشان دهند. احتمال مشاهده غیر همولوگی در مقایسه های مربوط به سطوح بالاتر طبقه بندی بیشتر می شود. بنابراین موقعی که مطالعه در سطح گونه صورت گیرد، مکان یابی خاص ژن توسط نشانگر مشهودتر خواهد بود.
۴ – همبارز بودن آلل ها
آلل های یک جایگاه ژنی توسط نشانگر همبارز به طور همزمان در یک فرد تظاهر می یابند. بنابراین در استفاده از نشانگرهای همبارز امکان تشخیص ناخالص ها از خالص ها وجود خواهد داشت. این مورد اجازه شناسایی ژنوتیپ ها و همچنین فراوانی آلل ها را در جایگاه های ژنی خواهد داد. برخلاف این، الگوی باندهای مربوط به نشانگرهای غالب به صورت وجود یا عدم وجود قطعه ها، با اندازه خاص، نمره دهی می شوند. از این رو در استفاده از این نوع نشانگرها افراد ناخالص قابل شناسایی نخواهند بود.
بنابراین در مطالعات ژنتیکی که بر پایه تجزیه های آماری بر روی فراوانی آلل ها مانند تخمین تمایز و فاصله های ژنتیک میباشند، نشانگرهای همبارز مفیدتر خواهند بود، نشانگرهای غالب می توانند به صورت همسو یا ناهمسو نسبت به ژن مورد نظر قرار گیرند. مثلا اگر ژن مورد نظر، مقاومت نسبت به یک بیماری باشد (صفت مقاومت غالب باشد)، در این حالت نشانگرهای غالب (مانند AFLP و یا RAPD) که نسبت به ژن مورد نظر به حالت همسو قرار دارند، نشانگرهای مقاومت غالب نامیده می شوند.
کارایی این نشانگرها در انتخاب غیر مستقیم ژن مقاومت، نسبت به نشانگرهایی که در حالت ناهمسو هستند، کمتر است. در حقیقت نشانگرهایی که با آلل حساس در جایگاه ژن مقاومت پیوستگی نشان می دهند، کارایی بیشتری در انتخاب غیر مستقیم دارند، اگرچه فراوانی نوترکیب بین جایگاه ژن مقاومت و نشانگر بیشتر از نشانگرهای پیوسته با آلل مقاوم باشد.
۵ – تکرارپذیری
استخراج DNA با کیفیت و خلوص مطلوب، شرط لازم برای به دست آوردن تکرار پذیری زیاد برای بیشتر نشانگرهای مولکولی است. برای مثال DNA های غیر خالص یا با کیفیت نامطلوب ممکن است برش اندونوکلئازها یا تکثیر DNA را تحت تاثیر قرار دهند.
در مورد نشانگرهای RAPD حتی وقتی DNA خالص با وزن مولکولی زیاد استفاده می شود تکرارپذیری اندک است. در حقیقت حتى انحرافات کم در شرایط آزمایش ممکن است الگوی بانددهی RAPD را تحت تاثیر قرار دهد. بنابراین روش های آزمایشی استاندارد شده برای بدست آوردن تکرارپذیری زیاد نشانگرهای RAPD مورد نیاز است.
۶ – زحمت کار
نشانگرهای DNA مبتنی بر پی.سی.آر زحمت کمتری دارند، درصورتی که نشانگرهای RFLP، ماهوارک ها و نشانگرهای پروتئینی (مبتنی بر الکتروفورز دو بعدی) نشانگرهای با زحمت زیاد به شمار می آیند، زیرا تجزیه برخی از آنها شامل لکه گذاری سادرن، نشاندار کردن پرتوزای کاوشگرها و دورگ گیری است.
همچنین مقدار اطلاعات به دست آمده از نمونه های ردیف یابی شده با PCR تا زمانی که از روش های خودکار استفاده نشده پر زحمت است، زیرا چهار واکنش ردیف یابی جدا برای هر نمونه لازم است. زحمت بقیه نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR، بر اساس روش های مورد استفاده کم تا متوسط است.
۷ – روش های مورد نیاز
نشانگرهای RFLP، ماهوارک ها و ردیف یابی PCR، به مهارت های تکنیکی برای نشاندار کردن پرتو زا نیاز دارند. علاوه بر این دورگ گیری های سادرن قسمتی از تجزیه های ماهوارک ها و RFLP است که تکنیک های زیادی را نیاز دارند. همچنین انجام الکتروفورز دو بعدی پروتئین به مهارت های خاص نیاز دارد. در صورتی که آلوزایم ها و نشانگرهای مبتنی بر PCR (مانند رپید و اسکار) در ژل های آگاروز قابل تجزیه اند و به تکنیک های زیادی نیاز ندارند.
۸ – هزینه های گردان
امکانات و تجهیزات آزمایشگاهی و همچنین مواد شیمیایی مورد نیاز به عنوان هزینه های گردان به شمار می آیند. مواد شیمیایی گران مانندآنزیم Taq پلیمراز برای PCR، آنزیم های محدودگر به ویژه آنزیم های اندونوکلئاز با برش فراوان در تجزیه AFLP و نشاندار کردن پرتوزا در اغلب موارد مورد نیازند. ژل های پلی اکریلامید نسبت به ژل های آگاروز بسیار گران ترند و به مشاهده چند شکلی ها از طریق خودپرتونگاری با رنگ آمیزی با نقره نیاز دارند که نسبت به رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید گران تر است.
۹ – هزینه های توسعه
اگر کاوشگرها یا اطلاعات ردیف DNA برای ایجاد آغازگر در دسترس نباشد، توسعه نشانگر بسیار پر هزینه خواهد بود. علاوه بر این امکانات، مهارت کافی برای ایجاد کاوشگر و آغازگر نیز باید وجود داشته باشد. ایجاد کاوشگر های مناسب برای دورگ گیری سادرن به ایجاد کتابخانه ژنومی، جدا کردن قطعه های DNA و بررسی ترکیبات متنوعی از آنزیم های محدودگر یا کاوشگرها به منظور بررسی قدرت چند شکلی نیاز دارد. همچنین برای ایجاد و توسعه آغازگرهای PCR خاص یک جایگاه (مانند تجزیه ریزماهواره ها)، ایجاد کتابخانه ژنومی و غربال کردن آنها به منظور شناسایی قطعه های مورد نظر ضروری است و در نهایت قطعه های شناسایی شده به منظور ایجاد آغازگر باید ردیف یابی شوند.
بنابراین سرمایه لازم برای ایجاد و توسعه نشانگر، بسته به هدف، باید در نظر گرفته شود. اگرچه می توان از پایگاه های اطلاعاتی ژنوم یک گونه برای ایجاد کاوشگرها، آغازگرها و اطلاعات ردیف DNA گونه دیگر استفاده کرد، ولی مفید بودن این اطلاعات به فاصله تکاملی دو گونه بستگی دارد. به طوری که هر چه دو گونه به هم نزدیک تر باشند، استفاده از این اطلاعات مفیدتر خواهد بود.
۱۰ – کمیت و کیفیت نمونه مورد نیاز
از آنجایی که نشانگرهای مبتنی بر PCR نیاز به مقدار کمی از DNA (۵ تا ۱۰۰ نانوگرم برای هر واکنش) دارند، نسبت به بقیه روش ها ترجیح داده می شوند. در صورتی که نشانگرهای RFLP و ریزماهوارک ها بیشترین مقدار DNA (۵ تا ۱۰ میکروگرم) را برای هر واکنش نیاز دارند.
در مورد نشانگرهای AFLP، به دلیل آنکه قطعه های DNA برش داده شده بعدا PCR می شود با مقدار حد واسط DNA (0/3 تا ۱ میکروگرم) برای هر واکنش مورد نیاز است. بنابراین زمانی که مقدار کمی از DNA موجود در دسترس باشد، استفاده از نشانگرهای مبتنی بر PCR مناسب تر است. برای تجزیه آیزوزایمی یا الکتروفورز دو بعدی، نمونه هایی با کیفیت مطلوب مورد نیازند. با توجه به اینکه پروتئوم موجود می تواند از بافتی به بافت دیگر و یا در مراحل تکاملی مختلف، متفاوت باشد، در نمونه گیری باید دقت زیادی صورت گیرد.
۱۱ – امکان خودکار کردن نشانگرها
از آن جا که روش های خودکار سبب افزایش مقدار اطلاعات بدست آمده از یک نمونه می شوند، روش های با قابلیت خودکار شدن ترجیح داده می شوند. اگرچه برای خودکار کردن روش ها، نیاز به سرمایه زیادی است، ولی استفاده و کاربرد وسیع آنها در دراز مدت بسیار بصرفه خواهد بود. تقریبا همه روش های مبتنی بر PCR قابلیت خودکار شدن را دارند. درحال حاضر تلاش بسیاری برای خودکار کردن فناوری های مرتبط با پروتئومیکس صورت می گیرد.
۱۲ – تشخیص تنوع ژنتیکی حقیقی
هرچه تکرار پذیری یکی نشانگر کمتر باشد تشخیص تنوع ژنتیکی حقیقی با استفاده از آن انشانگر کمتر خواهد بود. نشانگرهای مورفولوژیک بدلیل اینکه تحت تأثیر شرایط محیطی قرار می گیرند و همچنین به دلیل کم بودن تعداد آنها قادر به بررسی تنوع ژنتیکی حقیقی به طور معنی داری نخواهند بود. در مقابل نشانگرهای مولکولی تحت تأثیر شرایط محیطی قرار نمی گیرند و از طرف دیگر پوشش ژنومی مناسبی را ایجاد می نمایند.
بنابراین این نشانگرها قادرند نقاط چندشکلی با اطمینان بالاتری در اختیار قرار دهند و به عبارت دیگر تو حقیقی بیشتری را نشان خواهند داد. البته بایستی توجه داشت که هیچ نشانگری قادر به پوشش ژنومی کامل نمی باشد. از این رو امروزه از مجموع چند نشانگر مولکولی برای پوشش بیشتر ژنوم استفاده می شود.
از آنجائیکه هر نشانگر دارای مزایای مخصوص به خود است و پوشش ژنومی مخصوص به خود را نیز دارا می باشد. اطلاعات حاصل از بکارگیری این مجموعه با همدیگر به واقعیت نزدیکتر خواهد بود و تشخیص تنوع ژنتیکی را دقیق تر نشان خواهد داد. البته در بین نشانگرهای مولکولی نیز تفاوت هایی از نظر بررسی های تنوع ژنتیکی حقیقی وجود دارد.
منبع : کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران
دیدگاهتان را بنویسید