تعیین مقدار آمپلیکون در real time pcr
پیش از انجام یک آزمایش real time pcr، جهت تعیین مقدار آمپلیکون در real time pcrباید تصمیم گرفت که نتایج را به‌صورت مطلق یا نسبی تعیین مقدار کرد. تعیین مقدار مطلق، به‌اندازه مقدار توالی هدف در نمونه، به‌صورت تعداد نسخه یا غلظت بیان می‌شود. تعیین کمیت نسبی، مقدار نسبی را به‌صورت نسبت مقدار اولیه توالی هدف بین تیمارهای کنترل و تحت آزمایش را بیان می‌کند. که نسبت به یک استاندارد درونی مثلاً بیان یک ژن خانه‌دار نرمال‌سازی می‌شود. هر دو روش به‌طور معمول استفاده می‌شوند. اما تعیین کمیت نسبی نیاز به تنظیم زمانی کمتری دارد و برای بیشتر آزمایش‌ها می‌تواند استفاده شود.
تعیین کمیت مطلق مقدار آمپلیکون در real time pcr
تعیین کمیت مطلق نیاز به تولید یک منحنی کالیبراسیون استاندارد با استفاده از یک استاندارد دارد که به‌دقت مقدار یا تعداد نسخه آن تعیین شده است. بعلاوه، این روش وابسته به بازده‌های تکثیر یکسان برای کنترل توالی هدف است. این روش دقیق‌تر اما اغلب پر زحمت است. بعلاوه، اگر میزان mRNA تعیین می‌شود، ضروری است که بازده واکنش PCR کنترل شود، برای رسیدن به این هدف‌ها بهتر است که با مقدار RNA هدف معینی که برای PCR زمان واقعی به cDNA تبدیل می‌شوند، شروع نمود.
RNA را می‌توان با همسان‌سازی DNA هدف به درون یک ناقل مناسب که امکان تولید RNA را در محیط آزمایشگاهی فراهم می‌کند، تهیه نمود. بطور ویژه، این ناقلین از پیش‌برهای RNA پلی‌مراز، فاژهای SP6 ،T3 یا T7 استفاده می‌کنند. مثال آن‌ها مجموعه ناقل‌های Pgem پرومگا، Stratagene’s pBluescript و Invitrogen’s TOPO TA است. چندین کیت تجاری در دسترس هستند که تولید RNA را از این ناقل‌ها تسهیل می‌کنند. مانند سیستم Promega’s Riboprobe، سیستم Ambion’s MAXIscript و کیت نسخه‌برداری Stratagene’s RNAMaxx High Yield.
در صورتیکه DNA هدف تعیین مقدار می‌شود، الگوی DNA اولیه مناسبی باید بعنوان استاندارد فراهم شود. این استاندارد می‌تواند DNA ژنومی باشد، البته اگر تعداد نسخه و اندازه ژنوم مشخص باشد. یا پلازمیدی باشد که داری ژن هدف است. در صورتیکه DNA پلازمیدی استفاده می‌شود، باید مطمئن بود که خالص است و دارای RNA آلوده‌کننده نیست. که این حالت می‌تواند اندازه‌گیری A۲۶۰ را افزایش و تخمین تعداد نسخه را بالا نشان دهد.
رسم منحنی کالیبریشن استاندارد
استانداردی که برای رسم منحنی کالیبریشن استاندارد استفاده می‌شود، باید دارای جایگاه‌های اتصال آغاز باشد. که با جایگاه‌های توالی هدف یکسان باشند و محصولی تقریباً با اندازه و توالی یکسانی نسبت به‌توالی تحت آزمایش، تولید کند. زمانی که استاندارد به‌دقت تعیین میزان شد، به‌طور سریالی (ترتیبی) با افزایش ۳ تا ۱۰ برابری رقیق می‌شود. و در دامنه‌ای که برای پوشش دادن مقدار احتمالی هدف که انتظار می‌رود، در نمونه‌های مورد آزمایش باشد، کافی باشد.
هر رقت در سه تکرار ران می‌شود. مقدار CT میانگین از هر رقتی در برابر مقدار مطلق استاندارد موجود در نمونه رسم می‌شود، تا یک منحنی استاندارد بدست آید. مقایسه مقدارهای CT آزمایش با این منحنی استاندارد تخمینی از مقدار هدف در نمونه اولیه را بدست می‌دهد.
تعیین کمیت نسبی بیان یک ژن
تعیین کمیت نسبی بیان یک ژن در پاسخ به تیمارهای مختلف، مانند شاهد در برابر نمونه مورد آزمایش یا حالت بافت، مانند نمونه آلوده در برابر غیر آلوده و حالت‌های نموی مختلف را اندازه‌گیری می‌کند. این کار نیاز به استاندارد درونی مناسب برای کنترل کردن variability بین نمونه‌ها می‌باشد.
به‌طور ویژه ژن‌های خانه‌دار همانند بتا اکتین، سایکلوفیلین یا گلیسر آلدئید ۳- فسفات دهیدروژناز وجود دارند. ژن‌های خانه‌دار به‌عنوان مرجع درونی بین نمونه‌های مختلف عمل می‌کند و به نرمال کردن خطای آزمایشی کمک می‌کند. توجه دقیقی باید در انتخاب ژن خانه‌دار که برای بررسی استفاده می‌شود، به عمل آید و باید نشان داد که بیان این ژن خانه‌دار در حقیقت در کل تیمارهای اعمال شده یکسان است.
مزیت استفاده از روش تعیین مقدار نسبی آمپلیکون
مزیت استفاده از روش تعیین مقدار نسبی این است که احتیاجی به تولید یک منحنی کالیبراسیون استاندارد نیست. اگر بازده تکثیر کنترل و توالی‌های هدف یکسان باشد، می‌توان مقدار بیان نسبی را برای ژن هدف در نمونه‌های مختلف بیان‌شده، به‌صورت نسبت مقایسه کرد. سپس این نسبت با استفاده از بیان ژن خانه‌دار در همان نمونه‌ها نرمال‌سازی می‌شوند. چندین مدل ریاضی برای محاسبه بیان نسبی در دسترس هستند. فافل (۲۰۰۱)، فرمول ریاضی را بسط داد که سهم بازه‌های تکثیر PCR را در نظر می‌گیرد و به‌طور گسترده‌ای برای تعیین کمیت نسبی بیان ژن در ریل تایم پی سی آر زمان واقعی استفاده می‌شود.
دیدگاهتان را بنویسید