تاریخ :۱۷ بهمن ۱۴۰۱
چند شکلی در جایگاه های ریزماهواره ای

چند شکلی در جایگاه های ریزماهواره ای

  • در سال های گذشته روش های متفاوتی برای تعیین چند شکلی در جایگاههای ریزماهواره ها ایجاد شده اند که به طور گسترده به عنوان نشانگرهای مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند. بر حسب چگونگی طراحی آغازگرها (براساس نواحی مجاور ریزماهواره یا براساس نواحی داخل ریزماهواره) انواع متفاوتی از نشانگرها را به صورت زیر خواهیم داشت:

    ۱- PCR آغازگرهای ریزماهوارهای قلاب شده (AMP- PCR) یا تکثیر بین اس.اس.آر (ISSR)

    به منظور بهبود اختصاصی بودن آغازگر ISSR در واکنش های AMP- PCR و به منظور به کارگیری آغازگرهای با پایه دو نوکلئوتیدی برای انگشت نگاری DNA، روش هایی ایجاد شده است که از آغازگرهای SSR تغییر یافته با ردیف های غیر تکرار شونده به صورت قلاب شده در انتهای ‘۳ یا انتهای ‘۵ استفاده می کند. در این روش از تکرارهای دو تایی یا سه تایی نشاندار شده با مواد پرتوزا که در یکی از انتهاها با دو تا چهار نوکلئوتید قلاب (لنگر) شده اند، به عنوان آغازگرهای تکی PCR استفاده   می شود. محصولات تکثیر شده از طریق پرتونگاری قابل مشاهده خواهند بود. در این روش فقط بخشی از نواحی که توسط AMP- PCR قابل تکثیر بوده اند، تکثیر می شوند. از این رو تکرارپذیری این روش نسبت به روش AMP- PCR بیشتر است.

    تکثیر بین اس.اس.آر (ISA) بیانگر انگشت نگاری DNA را با استفاده از آغازگرهای SSR قلاب شده در انتهای ‘۳ یا ‘۵ به منظور تکثیر DNA بین نواحی SSR است. در برخی موارد محصول به دست آمده از آغازگرهای SSR قلاب شده در انتهای ‘۳ متفاوت از آغازگرهای SSR قلاب شده در انتهای ‘۵ است. در حقیقت فقط آغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۵ قادر به شناسایی تنوع آللی در داخل SSR هدف هستند. آغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۵ در مرز بالا دست SSR هدف قرار می گیرند و به سمت پایین دست حرکت می کنند. بنابراین محصولات بدست آمده از آغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۵ چند اشکلی های بیشتری را نشان خواهند داد. بزرگترین محدویت این روش این است که چند شکلی فقط مربوط به جایگاه های ژنی SSR هایی است که با فاصله مناسب در دو جهت معکوس قرار گرفته باشند. از این رو یک SSR تکی در ژنوم از طریق این نشانگر قابل آشکارسازی نخواهد بود. همچنین در استفاده از آغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۳، امکان شناسایی هر گونه تنوع آللی در داخل SSR هدف نخواهد بود. با وجود این در استفاده از آغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۵ مشکلات اختصاصی بودن آغازگر وجود خواهد داشت.

    ۲- تفاوت های ریزماهواره تکثیر شونده تصادفی یا رمپ (RAMP)

    روش RAMP که در حقیقت ترکیبی از روش های RAPD و SSR است، بر پایه توزیع تصادفی ردیف های نوکلئوتیدی مجاور ردیف تکراری است. در این روش تکثیر با استفاده از دو نوع آغازگر، یکی آغازگر SSR قلاب شده در انتهای ‘۵ و دیگری آغازگر رپید انجام می گیرد. تفاوت های مشاهده شده در این روش به دلیل تنوع در SSR هدف و یا به علت تنوع در جایگاه بین دو آغازگر است. در حقیقت در این روش جایگاه اتصال آغازگر RAPD به عنوان یک نقطه انتهایی و اختیاری برای تکثیر محصولات SSR عمل می کند. بنابراین برخلاف روش های تکثیر بین اس.اس.آر (ISA) محصولات بدست آمده از طریق جایگاه ژنومی به یک SSR خاص محدود نمی شوند. ترکیبات آغازگرهای مختلف SSR و RAPD اجازه ایجاد تعداد نامحدودی از قطعه های تکثیر شونده ای را می دهند که در یک انتها، ردیف تکرار شونده ریزماهواره ای دارند. از آنجاکه آغازگر SSR با ۲۳۲ یا P۳۳ نشاندار شده است، قطعه های تکثیر شده در ژل های پلی اکریل آمید قابل مشاهده خواهند بود. همچنین به دلیل آنکه فقط یک رشته از قطعه تکثیر شده نشاندار است، از شرایط ژل واسرشته نیز می توان استفاده کرد. به منظور سهولت در اتصال دو نوع آغازگر که دمای ذوب متفاوتی دارند و همچنین به منظور کاهش در تعداد قطعه های تکثیر شونده ای که فقط مربوط به آغازگر تصادفی ۱۰ نوکلئوتیدی می باشند، از پروفیل حرارتی غیر متقارن استفاده می شود. به طوریکه این برنامه بین اتصال در درجه حرارت زیاد و کم ارتباط برقرار می کند. بدین ترتیب که اجازه می دهد آغازگر SSR در درجه حرارت زیاد متصل شده و گروهی از قطعه ها را تولید کند. سپس با پایین آوردن درجه حرارت امکان اتصال آغازگر تصادفی ۱۰ نوکلئوتیدی را تامین می کند. این برنامه تکثیر جایگاه های غیر SSR را بوسیله آغازگر RAPD به کمترین حد می رساند. در کل ثابت شده است که از روش رمپ برای ایجاد نشانگرهای همبارزی که چند شکلی ردیف تکراری ساده را نشان می دهند می توان استفاده کرد.

    ۳- تکثیر انتخابی جایگاه های متفاوت ریز ماهواره ای یا سمپل (SAMPL)

    از جمله معایب روش STMS این است که نیاز به همسانه سازی و ردیف یابی برای طراحی آغازگر دارد. همچنین عیب دیگر این روش این است که آغازگرها عموما برای جایگاه های ژنی به صورت خاص عمل می کنند، در نتیجه در واکنش PCR، موجب تکثیر فقط یک جایگاه ژنی می شوند. این معایب به طور عمده در روش سمپل برطرف شده است. روش سمپل مزایای دو روش STMS و AFLP را دارد. اساس روش AFLP آشکار کردن قطعه های هضم شده DNA را از طریق تکثیر PCR و با استفاده از آغازگرهای منطبق بر سازگار سازهای ساختگی است، از این رو نیازی به دانستن DNA ژنوم هدف نیست. این روش سبب تکثیر همزمان نواحی چندگانه اختیاری در ژنوم و آشکارسازی چند شکلی های غالب بر اساس حضور یا عدم حضور جایگاه های برشی یا بر اساس تنوع تک نوکلئوتیدی بین ژنوم ها می شود. سمپل روش تغییر یافته، AFLP است که بر پایه SSR است و به منظور بهره گیری از همبارز بودن نشانگر و همچنین مزیت چندشکلی جایگاه های SSR در ژنوم طراحی شده است. در این روش از ریزماهواره ها برای طراحی آغازگرها استفاده می شود، بدون اینکه نیازی به همسانه سازی و ردیف یابی اولیه باشد. به طوری که در تکثیر اصلی از یک آغازگر AFLP که دارای سه نوکلئوتید اختیاری است، به همراه یک آغازگر سمپل که دست کم قسمتی از آن مکمل ردیف ریزماهواره است، استفاده خواهد شد. در این روش از همان سازگارسازهای روش AFLP استفاده می شود. اما تکثیر با استفاده از آغازگر SSR نشاندار شده با ۲۳۴ یا P۳ به همراه یک آغازگر غیر نشاندار منطبق بر سازگارساز آغازگر AFLP انجام می گیرد.

    ۴- تفاوت ریزماهواره تکثیر شونده تصادفی یا رمپو (RAMPO) یا دورگ گیری ریز ماهواره های تکثیر شده تصادفی(RAHIM) یا ریزماهواره های تکثیر شده تصادفی (RAMS)

    ریچاردسون و همکاران (۱۹۹۵) روش جدیدی را معرفی کردند که براساس انگشت نگاری الیگونوکلئوتیدی با استفاده از قطعه های رپید استوار بود. در حقیقت در این روش از مزایای انگشت نگاری الیگونوکلئوتیدی و روش رپید و همچنین روش AMP- PCR استفاده می شود. به طوری که DNA ژنومی با یک آغازگر ۱۰ نوکلئوتیدی رپید یا با یک آغازگر ۱۰ یا ۱۵ نوکلئوتیدی AMP- PCR تکثیر می گردد و سپس محصولات PCR الکتروفورز شده و با کاوشگرهای SSR (با تکرارهای یک، دو، سه و یا چهار نوکلئوتیدی) نشاندار شده با دیگر کسیژنین یا P۳ لکه گذاری و دورگ (هیبرید) می شوند. سپس با خود پرتونگاری می توان انگشت نگاری های تکرارپذیر و وابسته به کاوشگر بدست آورد. این روش دارای سرعت و حساسیت زیادی است و قادر است تعداد زیادی چند شکلی را نشان دهد.

    این روش با نام های متفاوت از قبیل: تفاوت ریزماهواره تکثیر شونده تصادفی یا رمبو (RAMPO)، دورگ گیری ریز ماهواره های تکثیر شده تصادفی (RAHM) و یا ریز ماهواره های تکثیر شده تصادفی (RAMS) ذکر شده است. ظهور باندهای رمپو به این دلیل است که هر یک از واکنش های رپید و AMP- PCR محصولات مختلف با فراوانیهای متنوع ایجاد می کند که بسیاری از قطعه های با فراوانی کم، قابل آشکار شدن از طریق اتیدیوم بروماید نیستند. با وجود این، به دلیل پراکنش ریزماهواره ها در تمامی نقاط ژنوم یوکاریوت ها، امکان مشاهده برخی از محصولات تکثیر شده با فراوانی کم را از طریق دورگ گیری امکان پذیر می سازد و به کمک روش رمپو می توان این قطعه ها را شناسایی کرد. باندهای دورگ شده در روش رمپو قابل جداسازی، همسانه سازی و ردیف یابی اند تا به عنوان کاوشگر در ژل هایRFLP و RAPD استفاده شوند. همچنین ردیف یابی نواحی مجاور ریزماهواره هاامکان ایجاد آغازگرهای STMS را فراهم خواهد کرد.

    منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.