آشنایی با نشانگرهای مولکولی RAPD
آشنایی با نشانگرهای مولکولی RAPD، تاریخچه ابداع تکنیک RAPD، ویژگی محصولات حاصل از تکنیک RAPD و آغازگرهای مورد استفاده در روش RAPD همگی در سایت دی مگ. امیدواریم این مطلب که حاصل تلاش تیم محتوا نویس سایت است مورد توجه شما سروران گرامی قرار گیرد.
تاریخچه ابداع تکنیک نشانگرهای مولکولی RAPD
یکی از محدودیت های اساسی روش های معمولی واکنش زنجیره ای پلیمراز برای نشانگرهای ALP این است که برای طراحی و ساخت آغازگرها به اطلاعات اولیه ای در زمینه ردیف بازی قطعه مورد نظر نیاز است. متاسفانه برای بیشتر گیاهان زراعی ردیف بازی بسیاری از نقاط ژنوم فعلا در دسترس نیست. بنابراین روشی که بتواند از مزایای واکنش زنجیره ای پلیمراز بهره جوید، ولی نیازمند اطلاعات اولیه در مورد ردیف بازی DNA مورد نظر نباشد، ضروری می نمود.
تاریخچه ابداع تکنیک RAPD
ویلیامز و همکاران، ولش و مکللند در سال ۱۹۹۰ به طور همزمان، ولی مستقل از یکدیگر روشی را ابداع و معرفی کردند که این ویژگی ها در آن لحاظ شده بود. ویلیامز و همکارانش نام DNA چند شکل تکثیر شده تصادفی را برای این روش برگزیدند. آنها در مقاله اصلی خود پیشنهاد کردند که این واژه به صورت «RAPD» خوانده شود.
آشنایی با نشانگرهای مولکولی RAPD
تکنیک نشانگرهای مولکولی RAPD چیست؟
در این روش برخلاف روش های استاندارد واکنش زنجیره ای پلیمراز، از تک آغازگرهایی به طول ۸ تا ۱۰ نوکلئوتید که ردیف بازی آن به طور قراردادی تعیین می گردد، استفاده می شود. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط مکمل خود را روی دو رشته DNA ژنومی می یابد و در آن نقاط به رشته های DNA متصل می شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته متقابل به هم نزدیک باشند (فاصله ای که DNA قابل تکثیر باشد)، ردیف بین آن دو نقطه طی واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر خواهد شد. روش RAPD به دلیل سهولت و هزینه کم، در موجودات مختلف به ویژه در گیاهان به وفور مورد استفاده قرار می گیرد.
روش هایی که از آغازگرهای اختیاری استفاده می کنند، در مجموع با عنوان نیمرخ ردیف های قابل تکثیر اختیاری چندگانه (MAAP) نامیده می شوند. RAPD یکی از سه روش پایه ای است که در آن از آغازگرهای اختیاری برای تکثیر قطعه های DNA الگو استفاده می شود. دو روش دیگر، PCR آغازگر اختیاری (AP- PCR) و انگشت نگاری با DNA تکثیر شده (DAF) است. این روش ها از نظر طول آغازگر، شرایط PCR و روش آشکار سازی قطعه های DNA تا حدی متفاوت اند. برخی از این روش ها می توانند زیرگروه نشانگرهای مربوط به خود را نیز داشته باشند.
فرآورده های واکنش زنجیره های پلیمراز بر روی ژل آگاروز از هم جدا می شوند. تولید هر باند بیانگر وجود شباهت زیاد بین ردیف بازی آغازگرها و ردیف بازی محل اتصال در DNA ژنوم است. به طور معمول هر آغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را در DNA ژنومی هدایت خواهد کرد.
ویژگی محصولات حاصل از تکنیک RAPD
وجود یا غیاب یک باند واحد در ژل های RAPD بیانگر جهش نقطه ای در محل اتصال آغازگرها و یا حذف یا اضافه شدن در ناحیه قابل تکثیر است. بنابراین چند شکلی در RAPD معمولا به شکل «حضور و غیاب» یک باند پدیدار می شود. بدین معنی که نشانگرهای RAPD از نوع غالب اند. افرادی که دو نسخه از یک آلل دارند، به طور کمی از افرادی که یک نسخه از آن آلل دارند، قابل تشخیص نیستند.
چندشکلی نشانگرهای RAPD یا به دلیل جهش های نقطه ای در مکان های اتصال آغازگر و یا به علت جهش هایی از قبیل حذف، ازدیاد و واژگونی در فاصله بین اتصال دو آغازگر است. محصولات چند شکلی حاصل از PCR بر روی ژل های آگاروز یا پلی اکریلامید از همدیگر تفکیک می شوند و در نهایت به وسیله رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید قابل دیدن خواهند بود.
نشانگرهای مولکولی RAPD
تفاوت طول قطعه ها در RAPD از طریق تکثیر قطعه های روش RAPD به دلیل سهولت و هزینه کم، در موجودات مختلف به ویژه در گیاهان به وفور مورد استفاده قرار می گیرد. مکمل با ردیف های آغازگرهای اختیاری ردیف مشخص ولی تصادفی به دست می آیند. قطعه های تکثیر شده به صورت نوارهایی با وزن مولکولی متفاوت به طور مستقیم بر روی ژل قابل مشاهده اند.
برای بدست آوردن محصولات PCR باید:
۱- دو آغازگر که هر دو دارای ردیف واحدی هستند، به رشته های مخالف بچسبند.
۲- دو آغازگر باید در جهت عکس هم آرایش یابند. یعنی انتهای آنها مجاور ناحیه ای باشد که قرار است تکثیر شود.
۳- دو آغازگر باید با فاصله ای کوتاه نسبت به همدیگر (معمولا کمتر از چهار جفت کیلوباز) به DNA الگو متصل شوند. دلیل این امر این است که پلی مراز Taq فقط در این فاصله می تواند فعال باشد و رشته دوم را سنتز کند. در حقیقت ساخته شدن رشته مکمل DNA به این دلیل است که پلیمراز Taq سبب طویل شدن آغازگر از انتهای ‘۳ (با اضافه کردن dNTPها) می گردد. بعد از چند چرخه PCR، قطعه های سنتز شده جدید نسبت به قطعه اولیه ژنومی غالب می شوند و از نظر تئوری به صورت توانی تکثیر خواهند شد.
آغازگرهای مورد استفاده در تکنیک RAPD
آغازگرهای مورد استفاده در روش RAPD، نه تا ۱۱ نوکلئوتید (معمولا ۱۰ نوکلئوتید) دارند که بیش از ۵۰ درصد نوکلئوتیدهای آنها را GC (به منظور اتصال محکم تر به DNA الگو) تشکیل می دهد. این آغازگرها فاقد تکرارهای معکوس داخلی اند و با اتصال به DNA هدف در دو جهت مخالف قادر به تکثیر DNA بین خود خواهند بود. تکثیر DNA الگو زمانی صورت می گیرد که محل های اتصال آغازگرها در رشته های مکمل الگو در فاصله ای باشد که DNA پلیمراز قادر به طی کردن آن باشد.
آشنایی با نشانگرهای مولکولی RAPD
نکته قابل توجه آن است که آغازگر RAPD ممکن است به ردیفی از الگو که ۱۰۰ درصد مکمل آن نیست، اتصال یابد. درحقیقت عدم جفت شدن کامل یا جفت شدن ناقص تا حدود ۳۰ درصد (یعنی ۳ باز از ۱۰ باز) در چرخه های اولیه تکثیر قابل تحمل است. با وجود این در انتهای ‘۳ آغازگر باید بیشترین همولوژی وجود داشته باشد تا پلی مراز Taq بتواند بچسبد و توسعه آغازگر را شروع کند.
البته بعد از چند چرخه نخست، یعنی پس از اینکه PCR ردیف دقیق آغازگر را ایجاد کرد، ۱۰۰ درصد همولوژی برای اتصال آغازگرها به وجود خواهد آمد. با کاهش دمای اتصال، میزان آغازگرهایی که به طور غیر اختصاصی به ردیف محل اتصال می چسبند، افزایش می یابد. باید توجه داشت که اتصال غیر اختصاصی می تواند در مورد موجوداتی که دارای ژنوم کوچک هستند (مانند قارچ ها) مفید باشد. زیرا جفت شدن کامل در این موجودات تعداد باند کمی را ایجاد می کند.
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران
دیدگاهتان را بنویسید