هر یک از جمعیت ها، تفرق ویژه ای از نشانگرها (جایگاه های ژنی) را نمایان می سازند. اطلاع از این نسبت ها برای تعیین تفرق همزمان نشانگر و ژن ضروری است. وقتی برای تجزیه جمعیت های تفرق یافته از نشانگرهای غالب و همبارز استفاده می شود و مشاهده می شود که نسبت تفرق برای هر مکان ژنی (نشانگر) از مقدار مورد انتظار انحراف ندارد، می توان نقشه های پیوستگی نشانگرها (نقشه های ژنتیکی) را طراحی کرد. این کار با استفاده از برنامه هایی از قبیل Mapmaker یا Joinmap قابل انجام است.
کاربرد نقشه پیوستگی ژن ها
یک نقشه پیوستگی – ژنتیکی ترتیب قرار گرفتن تعداد زیادی جایگاه ژنی شامل نشانگرهای مورفولوژیکی، ایزوزایمی، پروتئینی و نشانگرهای DNA در طول کروموزوم را نشان می دهد. فاصله بین این جایگاه های ژنی با سانتی مورگان (CM) نشان داده میشود که بیانگر مقدار نوترکیبی بین جایگاه های ژنی است.
باید توجه داشت که ارتباط خاصی بین فاصله نوترکیبی برحسب سانتی مورگان با فاصله فیزیکی برحسب جفت باز وجود ندارد. زیرا مقدار نوترکیبی در طول کروموزوم تغییر می کند. برای مثال در نواحی نزدیک به سانترومرها نوترکیبی کمتری وجود دارد که بیانگر نزدیک بودن نشانگرها به همدیگر در آن نقطه است.
مراحل ایجاد نقشه های پیوستگی بر اساس نشانگرهای RFLP:
۱ – ایجاد منبع کاوشگرها و شناسایی کاوشگرهای چند شکل
منبع RFLP، همسانه های تصادفی ژنوم و یا همسانه های مربوط به کتابخانه cDNA قابل استفاده می باشند. از آنجا که کاوشگرهای تک نسخه ای با کاوشگرهای با نسخه کم، الگوی باندی واضح تری ایجاد می کنند، نسبت به کاوشگرهای چند نسخه ای ترجیح داده می شوند. در حقیقت اگر کاوشگر دارای ردیف های تکراری باشد، در پرتونگاری وضعیت لکه یا اسمیر مشاهده خواهد شد، از این رو الگوی RFLP مبهم خواهد بود.
بنابراین فقط کاوشگرهایی که دارای سیگنال دورگ گیری قوی هستند، یعنی قطعه های کمی ایجاد می کنند و همزمان با آن بین والدین تفاوت نشان می دهند، برای تجزیه RFLP مناسب اند. از آنجا که برای تجزیه RFLP مقدار زیادی DNA را مورد نیاز است و از طرفی دورگ گیری سادرن نیز کار سختی است، از نشانگرهای مبتنی بر PCR مانند RAPD ،STS ،AST،SSR و AFLP و RFLP به فور برای ایجاد نقشه های پیوستگی ژنتیک استفاده میشود.
۲ – تجزیه تفرق
مهم ترین گام در تجزیه تفرق، انتخاب لاین های والدینی مناسب است. والدین باید از نظر ژنتیکی در حد کافی متفاوت باشند تا بتوانند تفاوت های کافی نشان دهند. از طرف دیگر نباید آن قدر از هم دور باشند که سبب عقیمی نتایج شوند.
-
روش کار تجزیه تفرق
۱- ابتدا DNA والدین جدا می شود و تحت تأثیر آنزیم های برشی متفاوت قرار می گیرد تا مشخص شود کدام آنزیم محدودگر تفاوت مناسب را بین والدین برای هر کاوشگر نشان می دهد.
۲- فقط ترکیباتی از کاوشگر – آنزیم برشی که تفاوت را بین والدین نشان داده اند ،برای مطالعه تفرق کاوشگرها (نشانگرها) در جمعیت تفرق استفاده می شوند.
۳- سپس والدین با هم تلاقی داده می شوند تا جمعیت تفرق، تلاقی برگشتی، لاین های اینبرد نوترکیب و یا هاپلوئیدهای مضاعف ایجاد شود.
۴- هر لاین اینبرد نوترکیب برای بلوک های پیوستگی کوچک از آلل های والدینی تثبیت شده است. لاین های هاپلوئید مضاعف نیز مانند لاین های اینبرد نوترکیب مزیت تثبیت شدن را دارند، از طرفی این لاین ها از طریق جنسی به وفور قابل تکثیرند. آنها فاقد اثرهای مادری بوده و ارتباط غالب و مغلوبی بین آلل ها حذف شده است و به راحتی در آزمایش های تکراردار قابل استفاده اند. از این رو می توان اجزای ژنتیکی و محیطی را از طریق تنوع فنوتیپی تخمین زد. لاین های هاپلوئید مضاعف طی یک نسل بدست می آیند، در صورتیکه چندین نسل برای ایجاد لاین های اینبرد نوترکیب مورد نیاز است.
۵- زمانیکه از جمعیت F2 یا تلاقی برگشتی استفاده شود، برای تعیین مجدد توزیع آلل های مربوط به نشانگرها، به جمعیت جدید تفرق نیاز خواهد بود. البته این مشکل با استفاده از جمعیت F3 به جای F2 حل می شود. برخلاف جمعیت F2 لاین های هاپلوئید مضاعف و اینبرد نوترکیب، جمعیت های با نقشه یابی دائمی به شمار می آیند و توسط محققان در آزمایشگاه های متفاوت قابل استفاده اند و اطلاعات این محققان را می توان در یک بانک اطلاعاتی گردآوری کرد.
۳ – تجزیه آماری
فراوانی های نوترکیب برای مقایسه های دو تایی بین جایگاه های ژنی با استفاده از روش بزرگترین درست نمایی تخمین و واحدهای نقشه با استفاده از تابع نقشه محاسبه می شوند. ایجاد نقشه های پیوستگی با استفاده از برنامه های رایانه ای مانند Linkage I و Mapmaker تسهیل می شود. انواع مختلف نشانگرها به ویژه نشانگرهای مبتنی بر PCR، ایجاد نقشه هایی پیوستگی با تراکم بالا را آسان می کنند. تکمیل اطلاعات به دست آمده از داده های سیتوژنتیکی، اموروفولوژیکی و آیزوزایم با اطلاعات مربوط به گروه های پیوستگی-ژنتیکی که براساس نشانگرهای DNA ایجاد شده اند با اهمیت است.
-
روش های انتساب گروه های پیوستگی به کروموزوم ها:
۱- استفاده از مخزن های ترانسلوکاسیون B -A
۲- استفاده از نشانگرهایی که جایگاه آنها قبلا بر روی کروموزوم ها تعیین شده است
۳- استفاده از کتابخانه های ژنی خاص کروموزوم
۴- استفاده از روش های دورگ گیری در محل و دورگ گیری در محل فلورسنس
۵- همچنین استفاده از مونوسومی ها، نولی سومی ها، آنیوپلوئیدها و لاین های جایگزینی.
نتیجه گیری:
همچنانکه گفته شد نقشه های ژنتیکی ترتیب و فاصله بین ژن ها و نشانگرها را در طول کروموزوم تعیین می کنند. بی گمان برای تجزیه QTL وجود نقشه های ژنتیکی به منظور تعیین جایگاه و فاصله QTL از ژن ها یا نشانگرها الزامی است. در یک نقشه ژنتیکی فاصله بین نشانگرها باید به صورت افزایشی باشد، به طوری که اگر یک جایگاه ژنی جدید (نشانگر جدید) به نقشه اضافه شود، ترتیب و فاصله نشانگرهای قبلی از یکدیگر را به هم نزند. از آنجایی که فراوانی نوترکیبی به صورت افزایشی نیست، از اینرو معیار مناسبی برای تعیین فاصله بین نشانگرها یا ژن ها به حساب نمی آید.
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران
دیدگاهتان را بنویسید