معرفی تکنیک RT-PCR

تاریخچه

از زمان معرفی تکنیک RT-PCR در سال ۱۹۷۷، استفاده زیادی از Northern blot برای کمّی سازی RNA با وجود کاستی های آن انجام شده است. RT-PCR تکنیکی زمان بر و به مقدار زیادی RNA برای تشخیص نیاز دارد. با این حال، از زمان اختراع تکنیک RT- PCR توسط کاری مولیس در سال ۱۹۸۳، روش Northern blot را به عنوان روش انتخابی برای تشخیص و تعیین مقدار RNA جابجا کرده است.

معرفی تکنیک RT-PCR

تکنیک RT-PCR نوعی واکنش زنجیره ای پلیمراز است که به طور معمول میزان بیان RNA را اندازه گیری می کند. در RT-PCR، DNA مکمل (cDNA) با رونویسی معکوس الگوهای RNA توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ساخته می شود. فناوری RT-PCR به عنوان معیاری برای شناسایی و یا مقایسه سطح RNA به چند دلیل افزایش یافته است:

1. به پردازش پس از PCR نیازی ندارد
2. طیف گسترده ای (> 107 برابر) از محتوای RNA قابل اندازه گیری است
3. بینشی از داده های کمّی و کیفی را فراهم می کند.

کاربردهای تکنیک RT-PCR

1. به دلیل سادگی، ویژگی و حساسیت RT-PCR، در طیف گسترده ای از آزمایشات از جمله اندازه گیری سلول های مخمر در شراب استفاده می شود.
2. به عنوان ابزار تشخیصی برای شناسایی عوامل عفونی. مانند ویروس آنفلوانزای مرغی و CoV-2-SARS
3. برای مطالعه کیفی بیان ژن استفاده می شود و می تواند با PCR زمان واقعی (Real time-PCR) ترکیب شود تا میزان کمّی RNA تعیین شود.
4. در آزمایشگاه های تحقیقاتی برای بررسی بیان ژن استفاده می شود. به عنوان مثال در آزمایش هایی برای تشخیص اگزون از اینترون
5. بصورت بالینی برای تشخیص بیماری های ژنتیکی و نظارت بر درمان دارویی استفاده شود.

مراحل تکنیک RT-PCR

برای تولید محصولات RT-PCR، به یک الگو RNA، آنزیم، نوکلئوتید، بافر و ترموسایکلر نیاز داریم. کیت هایی برای ساده سازی فرآیند موجود است. این تکنیک می تواند پیچیده باشد. زیرا RNase، آنزیمی که RNA را تخریب می کند، در همه جا وجود دارد و کوچکترین آلودگی DNA می تواند نتایج را مختل کند. برخی از موجودات مانند برخی از ویروس های RNAدار، ژنومشان تنها از RNA ساخته شده است. بعضی از ویروس ها مانند ویروس هپاتیت B هرگز به شکل DNA مابین در اثر آنزیم نسخه بردار معکوس درنمی آید.

در این روش ابتدا آنزیم نسخه بردار معکوس از ویروس های Avian Myeloblastosis Virus و Molony Murine Leukemia Virus بدست آمد. کاربرد این آنزیم به دلیل اینکه به حرارت حساس بود، در ابتدا پایین بود. ولی با کشف باکتری ترموس ترموفیلوس یک DNA پلیمراز مقاوم به نام Tth بهبود یافت.

1. آنزیم DNA پلیمراز Tth در حضور یون منیزیم دارای فعالیت نسخه برداری معکوس است و در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد توسط این آنزیم از روی RNA، دی ان ای ساخته می شود.
2. سپس منیزیم اضافی توسط اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EDTA) حذف می شود.
3. سپس این آنزیم از DNA ای که خود ساخته استفاده و آن را تکثیر می کند.

دکتر فاطمه سکه چی