آنالیز منحنی ذوب real time pcr
قبل از شروع آنالیز منحنی ذوب real time pcr، باید تأکید کرد که تحت شرایط PCR زمان واقعی تکثیر PCR اختصاصی است این کار را میتوان در ترمال سایکلر زمان واقعی با استفاده از خصوصیت آنالیز منحنی ذوب انجام داد. بکارگیری آنالیز نقطه ذوب پس از هر بار انجام دادن PCR زمان واقعی مرحله کنترل کیفی مناسبی است.
سودمندی آنالیز منحنی ذوب real time pcr
آنالیز منحنی ذوب real time pcr برای تمییز دادن آمپلیکون ها از آرتی فکت هایی مثل دایمر آغازگرها یا محصولات اشتباه تکثی رشده است. اگر نیاز باشد، آنالیز نقطه ذوب همچنین برای بهینهسازی دمای اتصال آغازگر مفید است. سودمندی آنالیز نقطه ذوب از آنجایی ناشی میشود که دماهایی که در آن یک DNA دو رشتهای واسرشته میشود، بستگی به طول و ترکیب نوکلئوتیدی دارد.
اندازهگیری سیگنال های فلورسنت
در زمانی انجام میشود که بهطور آهسته دمای محصولات واکنش (برای نمونه از ۶۰ تا ۹۵ درجه سانتیگراد) افزایش مییابد. در دمای پایین، آمپلیکون ها همه دو رشتهای هستند. بنابراین همه به سایبرگرین متصل میشوند و تولید سیگنال فلورسنت شدیدی میکنند.
همچنانکه دما افزایش مییابد محصولات PCR واسرشته میشوند و باعث کاهش فلورسنت میشوند. بهطور پیوسته فلورسنت اندازهگیری میشود و زمانی که به Tm یک محصول ویژه dsDNA کاهش سریع در فلورسنس در دامنه کوچکی از دما رخ میدهد. این حالت توسط دستگاه تشخیص داده میشود و یا بهعنوان فلورسنس کل یا دیفرانسیل منفی سیگنال فلورسنس، نسبت به دما رسم میشود.
مزیت روش دوم این است که plot بهصورت یک یا چند پیک با مرکزیت چند دما رسم میشود. این پیک ها نقطه هایی را نشان میدهند که میزان بیشینه تغییر دو فلورسنس تشخیص داده میشود.
محصولات آرتی فکت در real time pcr
آمپلیکون های مختلف ممکن است پیکهای مختلفی را با مرکزیت دماهای مختلف تولید کنند. و خوشبختانه آرتیفکت های PCR، بهطور شاخص، دماهای ذوب پایین تری نسبت به آمپلیکون هدفدارند.
با برنامهریزی دستگاه برای تشخیص فلورسنس در دمای مناسب، یعنی بالای دمای ذوب محصولات دایمر آغازگر و یا اشتباه تکثیرشده، اما پایینتر از دمای ذوب محصول هدف، میتوان با دقت بیشتری فلورسنتی آمپلیکون هدف را اندازه گرفت. بدون اینکه فلورسنس محصولات آرتی فکت را شامل شود.
منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران.
دیدگاهتان را بنویسید