خطا در تکنیک Real-time PCR

۱- مقدار کم یا کیفیت پایین محصول PCR

خطا در تکنیک Real-time PCR به این صورت می تواند باشد که RNA با کیفیت پایین باعث محصول کم در RT-PCR شود. ران کردن نمونه RNA روی ژل آگارز واسرشت‌کننده که دارای فرمالدهید است، می‌تواند درستی RNA را نشان دهد. محصول کم یا هیچ در RT-PCR ممکن است به دلیل ساخت ناکارآمد cDNA یا تکثیر پایین cDNA باشد.

این حالت ممکن است نیاز به انجام دادن واکنش‌های مختلف داشته باشد که مقدارهای مختلفی RNA به واکنش ساخت cDNA اضافه می‌شوند. به‌علاوه، مقدارهای متفاوتی از cDNA را می‌توان به واکنش PCR اضافه کرد. محصول پایین می‌تواند در نتیجه طراحی ضعیف آغازگر باشد. اگر محصول PCR کم است یا وجود ندارد، ممکن است طراحی جفت آغازگر جدید برای تکثیر لازم باشد. توالی آغازگر را بررسی کنید تا گرایش آن‌ها را برای تشکیل دایمر آغازگر تعیین کنید.

۲- شاهد منفی واکنش RT یک باند تولید می‌کند

اگر شاهد منفی واکنش RT یک باند تولید می‌کند، ممکن است RNA آلوده باشد. این حالت می‌تواند به دلیل آلودگی آمپلیکون در مواد RT یا در برخی موارد، آلودگی DNA ژنومی در نمونه RNA باشد. اغلب بهتر است که واکنش RT، با استفاده از مواد جدید تکرار شود (به‌جز نمونه RNA). اگر مشکل حذف شود، می‌توان پیش رفت. اگر مشکل باقی ماند، لازم است که یا نمونه RNA را با DNase عاری از RNase هضم یا RNA را دوباره استخراج کرد.

۳- شاهد منفی PCR باند تولید می‌کند

اگر شاهد منفی PCR باند تولید می‌کند، ممکن است آلودگی مواد با آمپلیکون وجود داشته باشد. اغلب بهتر است که واکنش PCR را با مواد جدید (به‌جز Taq) تکرار کنید. اگر مشکل حذف شد، می‌توانید پیش بروید. اگر مشکل باقی ماند، لازم است که Taq پلی‌مراز را برای آلودگی با تهیه تیوب جدید آنزیم آزمایش کنید. استفاده کردن از تیپ‌های فیلتر دار می‌تواند به جلوگیری از آلودگی کمک کند.

۴- تنوع زیاد بین نمونه‌های دوتایی یا سه‌تایی

اگر نمونه‌ها تنوع زیادی بین نمونه‌های دوتایی و سه‌تایی وجود دارد، ممکن است مشکل در آماده‌سازی مخلوط مادری یا خطای پیپت کردن وجود داشته باشد. بررسی کنید که مخلوط مادری درست تهیه و مخلوط شده باشد. و اینکه میکرو پیپت کالیبره شده و مقدار درستی از مایع را با تکرارپذیری پیپت کند.

۵- بازده تکثیر ضعیف

اگر منحنی تکثیر PCR در مقایسه با واکنش‌های PCR دیگر زود به plateau برسد، ممکن است بازده تکثیر پایین باشد (۹۰% >). بازده تکثیر را بررسی کنید: اگر ۹۰% > است، طراحی یا ساخت دوباره آغازگرها را در نظر بگیرید. طراحی دوباره آغازگرها را می‌توان با جابه‌جا کردن آن‌ها به محل متفاوت یا افزایش طول آن‌ها انجام داد. علاوه بر آن، اگر این کار را انجام نداده‌اید، بهینه‌سازی دقیق غلظت آغازگرها را با استفاده از ماتریکس آغازگر و با غلظت‌های متفاوت هر آغازگر انجام دهید و یا بهینه‌سازی دقیق دمای الگو را با آنالیز شیب دمایی انجام دهید.

خطا در تکنیک Real-time PCR

تولید دایمر آغازگر در تجزیه منحنی ذوب و روی ژل آگارز دیده می‌شود

وجود دایمرهای آغازگر را می‌توان پس از ران کردن محصول روی ژل آگارز یا با پیک دوم که در دمای پایین‌تری نسبت به آمپلیکون هدف ذوب می‌شود در تجزیه منحنی ذوب مشاهده کرد. این حالت به این دلیل رخ می‌دهد که غلظت الگو خیلی پایین است. افزایش غلظت الگو می‌تواند کمک کند.

تکثیر غیراختصاصی باعث به وجود آمدن چندین پیک در تجزیه منحنی ذوب و چندین باند روی ژل آگارز می‌شود

پیک‌های چندتایی را می‌توان در تجزیه منحنی ذوب مشاهده کرد، که با مشاهده چندین باند روی ژل آگارز محصول PCR تائید شده‌اند. برای رفع این مشکل مطمئن شوید که از Taq پلی‌مراز hot-start استفاده شود و دمای اتصال به‌اندازه کافی برای آغازگرها بالاست (بالاتر از ۶۰ درجه سانتی گراد). اگر مشکل باقی بماند ممکن است لازم باشد که آغازگرها دوباره طراحی شوند.

چندین پیک (دونمایی Bimodal) در منحنی ذوب هستند اما باندهای اضافه روی ژل آگارز وجود ندارند

ممکن است چندین باند یا پیک را در تجزیه منحنی ذوب مشاهده کرد. حتی اگر که محصول روی ژل آگارز تنها یک باند را نشان دهد. این حالت می‌تواند به دلیل تفاوت توالی درونی (مقدار G:C بالا در یک ناحیه در برابر ناحیه دیگر) باشد که نتیجه‌اش تفاوت در مشخصه ذوب می‌شود. اگر ژل آگارز تنها یک باند نشان می‌دهد، فرض کنید که پیک‌های دونمایی در تجزیه منحنی ذوب ویژه هدف هستند.