مواد گیاهی:
برگ های گیاه توتون
روش کار:
۱- قطعاتی از برگ های گیاهان رشد یافته در شرایط این ویترو و یا گیاهانی که در گلدان قرار دارند، جدا نماید.
۲- برگ ها را از گیاه استریل جدا نموده، آنها را با استفاده از آب و یک ماده شوینده ملایم، به آرامی بشویید. برگ ها را به مدت ۶۰-۳۰ ثانیه در الکل ۷۰٪ فرو ببرید. سپس به مدت ۵ الی ۱۰ دقیقه در محلول ۱۰٪ هیپو کلریت سدیم تجارتی خیس کنید، تا استریل شوند. در نهایت ریز نمونه ها را ۳ مرتبه با آب مقطر استریل شستشو دهید.
۳- قطعات برگ را در پتری دیش استریل قرار داده و آنها را با پنس و اسکالپل استریل به قطعات کوچکتری با مساحت تقریبی یک سانتیمتر مربع برش دهید. در ریزنمونه ها نبایتی رگبرگ وجود داشته باشد.
۴- قطعات برگ را به محیط کشت MS + ۱ – ۲ mg/l 2,4-D منتقل نمایید.
۵- کشت ها را در تاریکی و دمای ۲۵ درجه سانتیگراد قرار دهید. بافت کالوس پس از ۴-۳ هفته تولید خواهد شد.
۶- برای ساقه دهی، قطعاتی از کالوس را به اندازه تقریبی ۰/۵ سانتی متر به محیط کشت زیر منتقل نمایید:
MS + ۱-۲ mg/L BAP + ۰/۱ – ۰/۲ mg/L NAA
۷- ظروف کشت را درز گیری نموده و در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد، تحت فتوپریود ۱۶ ساعت با شدت نوری ۱۰۰۰ لوکس در انکوباتور قرار دهید.
۸- بعد از سه هفته ساقه ها تشکیل می شوند. تغییرات حاصله را در فواصل زمانی منظم ثبت نمایید.
۹- بافت ها را به قطعات کوچکی برای تکثیر ساقه برش دهید. هر قطعه بایستی حداقل دارای یک نوک یا رزت باشد. قطعات مزبور را در همان محیط کشت متناظر کشت دهید.
۱۰- برای ریشه دهی، ساقه هایی را که به حد کافی رشد نموده اند، به محیط کشت فاقد هورمون و یا دارای مقدار اندکی اکسین (۰/۵mg/l) که تسریع کننده ریشه زایی است، منتقل نمایید.
شکل گیری گیاه کامل
۱۱- گیاهچه هایی را که به خوبی ریشه دار شده اند، به آرامی از ظروف کشت خارج نموده و ضمن اینکه از صدمه زدن به ریشه خودداری می نمایید، ریشه ها را با جریان آب ولرم شستشو دهید تا آگار چسبیده به آنها شسته شود.
۱۲- گیاهچه ها را به گلدان های پلاستیکی محتوی خاک استریل انتقال دهید. خاک گلدان بایستی حتما مرطوب باشد. پس از انتقال گیاهچه به خاک، روی آن را با یک بشر به صورت واژگون و یا ایجاد خیمه ای از جنس پلاستیک بپوشانید (از لیوان های پلاستیکی شفاف یک بار مصرف استفاده کنید. این گیاهچه در طی چند روز اول نیاز به آب ندارد.
۱۳- ظروف را تحت تابش نور قرار دهید. هر روز به مدت چند دقیقه با باز کردن خیمه پلاستیکی و یا برداشتن بشر، اجازه دهید تبادل هوا صورت بگیرد. پس از گذشت یک هفته این مدت زمان را به یک ساعت در روز و در هفته بعد تدریجا به چند ساعت در روز افزایش دهید. پس از ۳-۲ هفته پوشش روی گیاه را کلا بردارید تا گیاه خود را با شرایط محیطی وفق دهد.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید