استفاده از سایبرگرین در Real time-PCR

استفاده از سایبرگرین در Real time-PCR

روش زیر نحوه استفاده از سایبرگرین برای تکثیر در Real time-PCR را شرح می‌دهد. سه روش پشتیبانی وجود دارند که برای تجزیه دقیق نتایج PCR مهم هستند. این روش‌ها شامل روش تعیین بازده تکثیر، روش فافل برای تعیین کمّی توالی هدف و ساخت یک منحنی استاندارد برای تعیین کمیت مطلق است.

درحالیکه می‌توان مواد لازم را برای PCR زمان واقعی خود تهیه کرد، بسیاری آزمایشگاه‌ها کیت‌هایی که مواد تهیه‌شده را دارند، از سازندگان می‌خرند. به‌طور ویژه، کیت‌های PCR زمان واقعی، پلی‌مراز و سایبرگرین را در غلظت‌های ایده آل برای تکثیر کارآمد و تشخیص cDNA، ارائه می‌دهند. بسیاری سازندگان کیت‌هایی را ارائه می‌دهند که برخی از آن‌ها برای مواد شیمایی ترمال سایکلر خاصی ساخته‌شده‌اند. کیت Quantitect SYBR Green PCR که توسط شرکت کیاژن فروخته می‌شود، مثالی از یک کیت است که استفاده گسترده‌ای دارد و می‌توان آن را در بسیاری ترمال سایکلرهای زمان واقعی به کار برد.

مقدمه‌چینی این روش حدود ۳۰ تا ۶۰ دقیقه برای نصب کردن، حدود ۳ ساعت ران کردن برنامه PCR و ۱ تا ۲ ساعت دیگر برای تجزیه نتایج آن زمان لازم است که بستگی به تعداد نمونه‌ها و راحتی استفاده از نرم‌افزار دارد. معمولاً سازندگان، جزئیات چیزهایی که در مخلوط مواد آن‌هاست، آشکار نمی‌کنند. در هر صورت، چند نکته را می‌توان در مورد اجزاء اشاره کرد که به تشریح اینکه چرا در مخلوط وجود دارند، کمک می‌کند.

استفاده از سایبرگرین در Real time-PCR

مخلوط واکنش

1. DNA پلی‌مراز HotStarTaq،
2. بافر QuantiTect SYBR Green PCR،
3. مخلوط dNTP،
4. سایبر گرین I،
5. رنگ غیرفعال راکس(ROX)
6. ۵ میلی مولار MgCl_۲

• DNA پلی‌مراز HotStarTaq: اصلاح‌شده DNA پلی‌مراز Taq است که به‌صورت غیرفعال عرضه می‌شود. استفاده از DNA پلی‌مراز HotStarTaq، احتمال تشکیل محصولات اشتباهی ساخته‌شده یا دایمر آغازگرها را کاهش می‌دهد. این پلی‌مراز به‌طور ویژه پس از ۱۰ تا ۱۵ دقیقه مرحله اینکوبیشن در ۹۵ درجه سانتیگراد فعال می‌شود.
• بافر QuantiTect SYBR Green PCR میزان برابری از KCl و (NH_۴)_۲SO_۴ دارد. تا طبق گفته سازنده آن، در طی مرحله اتصال، اتصال اختصاصی آغازگر به حالت غیراختصاصی ترجیح داده شود.
• dNTPs که در مخلوط واکنش وجود دارند، معمولاً هر کدام در غلظت نهایی ۲/۰ میلی مولار هستند.
• معمولاً سایبرگرین در واکنش نهایی در رقت ۱:۱۰۰۰۰ محلول ذخیره سایبرگرین حضور دارد.
• راکس که رنگ غیرفعالی است و در واکنش شرکت نمی‌کند. به‌عنوان رنگ مرجع در برخی دستگاه‌ها از جمله Applied Biosystems ،Mx3000P ،Mx3005P ،Mx4000 استفاده می‌شود.
• MgCl_۲ در غلظت بهینه برای بیشتر واکنش‌ها استفاده می‌شود اما اگر لازم باشد، می‌توان MgCl_۲ بیشتری اضافه کرد.

روش کار استفاده از سایبرگرین در Real time-PCR

روشی که در زیر شرح داده می‌شود بر اساس کیت Qiagen QuantiTect SYBRT Green است. کیت QuantiTect SYBR Green PCR را می‌توان از شرکت کیاژن تهیه نمود. هر توالی هدف که شامل ژن‌های خانه‌دار نیز می‌شود، جفت آغازگر خود را دارد و می‌تواند به‌صورت زیر تکثیر شود.

مخلوط مادری PCR

• مخلوط واکنش ۲x
• ۵۰ میکرو مولار آغازگر رفت
• ۵۰ میکرو مولار آغازگر برگشت
• آب عاری از RNase
• cDNA
• تیوب‌های ۱/۵میلی‌لیتری برای تهیه مخلوط مادری
• تیوب‌های با دیواره نازک
• ترمال سایکلر زمان واقعی

جدول اجزاء مخلوط واکنش Real time-PCR

توجه: این روش نحوه انجام PCR زمان واقعی را نشان می‌دهد. زمانی که آزمایش مقایسه نمونه‌ها باهم انجام می‌شود مهم است که پیش از تجزیه نمونه‌ها، بازده‌های تکثیر مشخص شوند. توالی‌های هدف و خانه‌دار را می‌توان با استفاده از مخلوط‌های مادری جدا تکثیر کرد.

دستورالعمل

۱- فضای کار را تمیز کنید. مطمئن شوید فضای کار تمیز و به دور از distractions است.

۲- زمانیکه با چندین تیوب کار می‌کنید در روی یخ قرار دهید.

۳- یک مخلوط مادری PCR در تیوب‌های ۱/۵ میلی‌لیتری، چنانچه در جدول نشان داده‌ شده، آماده کنید تا یکسان بودن را به حداکثر و زحمت را به حداقل برسانید. مخلوط مادری را کاملاً مخلوط‌ کنید و مقدارهای یکسانی را در هر تیوب دیواره نازک PCR توزیع کنید. یک مخلوط مادری ۵۰x به‌صورت نمونه نشان داده‌ شده. به‌طور ویژه، هر نمونه در ۳ تکرار انجام می‌شود. هدف و ژن خانه‌دار. مخلوط‌های مادری را می‌توان اضافه بر چیزی که نیاز است ساخت تا تفاوت در پیپت کردن را هم به‌حساب بیاورید.

۴- الگو را به مقدار لازم به هر تیوب اضافه کنید (cDNA). مطمئن باشید که یک کنترل منفی که الگو ندارد را اضافه کنید.

۵- دستگاه PCR را روشن و طبق دستور سازنده برنامه‌ریزی کنید.

۶- تیوب‌ها را در ترمال سایکلر قرار دهید و برنامه را شروع کنید.

۷- می‌توان آنالیز منحنی را نیز انجام داد تا از اختصاصی بودن تشکیل محصول مطمئن شد. اگر دایمر­های آغازگر یا محصول غیراختصاصی دیگری شناسایی شود، مرحله جمع‌آوری داده‌ها باید روی دمایی که بالاتر از دمای محصول غیراختصاصی و ۳ درجه سانتی گراد پایین T_m محصول اختصاصی است، تنظیم شود.

۸- واکنش PCR را ران کنید تا مقدار C_T را برای هر نمونه مشخص کنید. مهم است که مقدار C_T برای توالی هدف و ژن خانه‌دار را برای هر نمونه داشته باشیم.

دکتر فاطمه سکه چی