سنتز cDNA با آنزیم نسخه‌برداری معکوس

سنتز cDNA با آنزیم نسخه‌برداری معکوس

سنتز DNA از یک RNA الگو و از طریق آنزیم نسخه‌برداری معکوس، DNA مکمل (cDNA) را تولید می کند. رونویسی های معکوس (RT) از یک RNA الگو و یک آغازگر کوتاه مکمل انتهای ‘۳ RNA برای هدایت سنتز رشته اول cDNA استفاده می کنند، که می تواند مستقیماً به عنوان الگویی برای واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) استفاده شود.

این ترکیب رونویسی معکوس و PCR (RT-PCR) امکان شناسایی RNA با فراوانی کم در یک نمونه و تولید cDNA مربوطه را فراهم می کند، در نتیجه کلون سازی از ژن های با نسخه برداری پایین را تسهیل می کند. متناوباً، رشته اول cDNA می تواند با استفاده از DNA Polymerase I و DNA Ligase رشته دوم را سنتز کند. از این محصولات واکنش می توان برای کلون سازی مستقیم بدون تکثیر استفاده کرد.

سنتز cDNA از RNA کل

روش سنتز cDNA از RNA کل خالص‌سازی شده از سلول‌ها یا بافت‌ها با استفاده از تکنیک استخراج فنل-گوانیدیوم تیوسیانات-کلروفرم توسط چامسزینسکی و ساکی در سال ۱۹۸۷ تشریح شد. ساخت رشته اول cDNA می‌تواند با استفاده از هگزامر­های تصادفی، الیگو (dT) یا آغازگرهای ویژه ژن باشد. الیگو (dT) روش ترجیح داده‌شده برای این روش است. زیرا به‌طور انتخابی با دنباله‌های ۳ پلی (A) که در نزدیکی انتهای mRNA ی یوکاریوتی یافت می‌شود، دو رگ می‌شود.

برخی روش‌ها نیازمند مخلوطی از هگزامرهای تصادفی و الیگو (dT) هستند، گرچه که این روش از الیگو (dT) در تکثیر اولین رشته استفاده می‌کند. روش زیر یک واکنش شاخص است که برای تبدیل ۱ پیکو­گرم تا ۵ میکروگرم RNA کل به cDNA طراحی‌شده است. این روش از روش شرکت Invitrogen اقتباس‌شده است.

مواد لازم برای سنتز cDNA با آنزیم نسخه‌برداری معکوس

• RNA کل حل‌شده در آب تیمار شده با DEPC
• آغازگرهای ساخت رشته اول cDNA
• مخلوط ۱۰ میلی مولار dNTP (نوکلئوتیدهای آزاد)
• H_۲O تیمار شده با DEPC
• بافر x RT10
• ۲۵ میلی مولار MgCl_۲
• ۱/۰ مولار DDT (دی تیو تریتول) که برای احیاء پیوندهای دی سولفیدی به کار می‌رود
• بازدارنده RNase (برای نمونه بازدارنده ریبونوکلئاز RNasin؛ اغلب ۲۰ تا ۴۰ واحد/ میکرومول)
• ترانسکریپتاز معکوس M-MLV (RNase- H)
• RNase H
• تیوب‌های ۵/۰ میلی‌لیتری میکروسانتریفیوژ، عاری از RNase و DNase
• انکوباتورهای ۳۷ و ۶۵ درجه سانتی گراد
• بلوک حرارتی ۸۵ درجه سانتیگراد 

نکات لازم

۱- برای جلوگیری از آلودگی نمونه‌ها با RNase، باید در تمام مدت دستکش پوشیده شود. شستن دست‌ها با محلول رقیق SDS (%0/01) به حذف RNase های آلوده‌کننده کمک می‌کند.

۲- میکروپیپتورهای مجهز به تیپ‌های صافی نگه‌دارنده (Barrier-filter) باید برای پیپت کردن محلول‌ها استفاده شوند. این کار از ورود آلوده‌کننده‌هایی که در لوله میکروپیپتورها قرار دارند، جلوگیری می‌کند.

۳- نمونه را به‌سرعت با ورتکس مخلوط و هر جزء را به مدت ۱۵ ثانیه با تمام سرعت، در یک میکروسانتریفیوژ رومیزی سانتریفیوژ کنید تا نمونه‌ها در ته تیوب واکنش جمع شوند. این کار را می‌توان در دمای اتاق انجام داد.

روش کار

۱- مواد زیر را به داخل تیوب‌های میکروسانتریفیوژ ۵/۰ میلی‌لیتر عاری از RNase و DNase بریزید.

۲- واکنش را به مدت ۵ دقیقه در ۶۵ درجه سانتی گراد انکوبه کنید تا RNA واسرشته شود، به‌طور مختصر، میکروسانتریفیوژ کنید تا محلول را به ته لوله بیاورد و روی یخ قرار دهید.

۳- مخلوط ساخت cDNA را با افزودن هر یک از این اجزاء به ترتیب زیر آماده کنید:

۴- مخلوط ساخت cDNA را به مخلوط آغازگر RNA اضافه کنید. با پیپت کردن به‌ آرامی مخلوط‌کنید و با میکرو­سانتریفیوژ کردن مختصر، همه مایه را جمع کنید. مخلوط واکنش را به مدت ۵۰ دقیقه در ۵۰ درجه سانتیگراد انکوبه کنید. بسته به نوع آنزیم استفاده‌شده در مخلوط، دما می‌تواند بین ۴۲ تا ۵۰ متغیر باشد. واکنش‌هایی که در دمای بالاتر انجام می‌شوند، ساختار دوم RNA را بازی می‌کنند که این ساختارها، توالی RNA را mask می‌کنند و آنزیم نسخه برداری معکوس را از نسخه‌برداری رشته الگو در این ناحیه بازمی‌دارند.

۵– با حرارت دادن نمونه‌ها تا ۸۵ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه واکنش را به پایان برسانید. نمونه‌ها را به مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار دهید، نمونه‌ها را سانتریفیوژ کنید و دوباره روی یخ قرار دهید.

۶- مقدار ۱ میکرولیتر از RNase H را به تیوب اضافه و به مدت ۲۰ دقیقه در ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه کنید. می‌توان cDNA را در ۲۰- یا ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری یا فوراً برای تکثیر PCR استفاده نمود.

دکتر فاطمه سکه چی