انواع روش های جداسازی پروتوپلاست ها
پروتوپلاست ها
پرتوپلاست، که سلول گیاهی بدون پوشش نیز نامیده می شود، شامل تمام اجزاء سلول به جز دیواره آن می باشد. هانستین (Hanstein) در سال ۱۸۸۰ واژه پروتوپلاست را برای مواد زنده محصور در غشاء سلولی گیاهی به کار برد.در این مقاله از دی مگ به معرفی انواع روش های جداسازی پروتوپلاست ها وتاریخچه جداسازی پروتوپلاست از سلول های گیاهی می پردازیم.
انواع روش های جداسازی پروتوپلاست ها
در انواع روش های جداسازی پروتوپلاست ها، پروتوپلاست جدا شده یک ساختار غیر عادی است. زیرا که غشاء پلاسمایی بیرونی کاملا در معرض محیط بوده و تنها حصار موجود بین محیط بیرون و مواد زنده داخل سلول است.
تاریخچه جداسازی پروتوپلاست از سلول های گیاهی
جداسازی پروتوپلاست از سلول های گیاهی، اولین بار با اعمال ریز جراحی (Microsurgery) بر روی سلول های پلاسمولیز شده به روش مکانیکی صورت گرفت. اما بازده این روش بسیار اندک بود و مفید واقع نشد. اولین بار کوکینگ (Cocking) در سال ۱۹۶۰ برای آزادسازی پروتوپلاست ها از آنزیم استفاده کرد. وی آنزیم سلولاز را از کشت قارچ Myrothecium verrucaria جدا نموده و برای تجزیه دیواره های سلولی به کار برد.
کوکینگ از آنزیم هیدرولیز کننده سلولز برای جداسازی پروتوپلاست ها از نوک ریشه های گوجه فرنگی استفاده کرد. از آن زمان به بعد، ترکیبات آنزیمی زیادی برای جداسازی پروتوپلاست ها مورد استفاده قرار گرفته اند. و پرکاربردترین انواع آنها امروزه به صورت تجارتی در دسترس هستند.
به زودی استفاده از آنزیم های تجزیه کننده دیواره سلولی به عنوان روشی ترجیحی جهت جداسازی تعداد زیادی پروتوپلاست های یکنواخت، مد نظر قرار گرفت. این پروتوپلاست ها در تعدادی از گونه های گیاهی در شرایط ایده آل برای سنتز دیواره سلولی با موفقیت کشت شده اند و امروزه دستورزیهای ژنتیکی نیز بر روی آنها صورت گرفته است. پروتوپلاست ها نه تنها در مطالعات تلفیق سلولها مفید هستند، بلکه قادر به جذب DNA خارجی، اندامکهای سلولی، باکتریها و ذرات ویروسی از طریق غشاء پلاسمایی بدون پوشش خود نیز می باشند.
انواع روش جداسازی پروتوپلاست ها
پروتوپلاست ها به دو روش مکانیکی و آنزیمی جداسازی می شوند:
۱- جداسازی پروتوپلاست ها به روش آنزیمی
در این روش از سلول های بزرگ و مملو از واکوئل بافت های ذخیره ای نظیر سلول های فلس های پیاز و یا ریشه غده ای ترب و چغندر، برای جداسازی پروتوپلاست استفاده می شود. در ابتدا سلول ها پلاسمولیز می شوند، که این فرآیند، به عقب نشینی محتویات سلولی به سمت مرکز سلول منجر می شود. سپس بافت مورد نظر را جدا و دپلاسمولیز می نمایند، تا پروتوپلاست ها آزاد شوند.
کلرکر (Clercker) در سال ۱۸۹۲ پروتوپلاست هایی از Stratiotes aloides را به همین روش جداسازی نمود. در گیاه Saintpaulia konanthia با کشت برگهای توسعه یافته در یک محیط اکسینی ویژه، بافت کالوسی تولید شد که سلول های آن از دیواره نازکی برخوردار بودند و سپس ابا خراش آرام در این بافت کالوس، پروتوپلاست های گیاه مزبور به صورت مکانیکی تولید شده اند. با این حال، از این روش به دلیل معایب خاصی که دارد استفاده نمی شود.
جداسازی پروتوپلاست های آرابیدوپسیسجداسازی پروتوپلاست های آرابیدوپسیس
-
معایب جداسازی پروتوپلاست ها به روش مکانیکی
۱- این روش محدود به بافت هایی است که سلول های آنها دارای واکوئل های بزرگی هستند.
۲- تولید پروتوپلاست ها بسیار کم است. پروتوپلاست هایی که از بافتهای کم واکوئل و شدید مریستمی تهیه می شوند، از بازده خوبی برخوردار نیست.
۳- این روش خسته کننده و پرزحمت است.
۴- در اثر حضور موادی که توسط سلول های صدمه دیده ترشح می شود، قابلیت حیات پروتوپلاست ها کاهش می یابد. در مواردی که استفاده از آنزیمهای تجزیه کننده دیواره سلولی باعث بروز اثرات جانبی می گردد، کاربرد روش مکانیکی مفید است.
۲- روش آنزیمی
کوکینگ در سال ۱۹۶۰ امکان استفاده از آنزیم ها را در جداسازی پروتوپلاست های گیاهان عالی نشان داد. وی از محلول غلیظی از آنزیم سلولاز برای هضم دیواره سلولی استفاده کرد. با این وجود، تا ۱۰ سال بعد که فرمولاسیون های تجارتی آنزیم ها به بازار عرضه شد، کار قابل توجهی صورت نگرفت.
اولین بار تاکاب (Takabe) و همکاران در سال ۱۹۶۸ از فرمولاسیونهای تجارتی آنزیم ها برای جداسازی پروتوپلاست استفاده کردند. و در سال ۱۹۷۱ نیز موفق به باززایی گیاه از پروتوپلاست ها می کنند. سپس لوله های سانتریفیوژ محتوی پروتوپلاست ها را به مدت ۵۰-۴۰ دقیقه در حمام آبگرم با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار می دهند. پس از این تیمار، ۲۰ الی ۵۰ درصد پروتوپلاست ها با یکدیگر امتزاج می یابند.
منبع: کتاب اصول بیوتکنولوژی گیاهی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، چاپ ششم.
دیدگاهتان را بنویسید