تاریخ :۹ بهمن ۱۴۰۱
توالی یابی DNA

روش های توالی یابی DNA

  • روش های توالی یابی DNA

    روش های توالی یابی DNA به طور عمده به دو روش پایاندهی زنجیره و قطع شیمیایی صورت می گیرد. از نظر پایه ای دو روش توالی یابی یکسان اند. در هر دو روش هدف بدست آوردن خانواده هایی از مولکول های DNA، جدا کردن این خانواده ها به وسیله الکتروفورز و ایجاد یک الگوی باندی است. که می توان از روی آن ردیف مولکول اولیه را تشخیص داد.

    تفاوت دو روش در طریقه بدست آوردن خانواده هایی از مولکول های ختم شده به G ،C ،A و T است. این خانواده ها در روش قطع شیمیایی توسط سنتز رشته های جدید تولید نمی شوند. بلکه از طریق شکستن مولکول های موجود با مواد شیمیایی که پلی نوکلئوتیدها را به طور اختصاصی در مکان های نوکلئوتیدی C ،A و G یا T قطع می کنند، ایجاد می شوند.

    روش پایاندهی زنجیره در توالی یابی DNA

    در روش پایاندهی زنجیره، ساخته شدن رشته به کمک PCR صورت می گیرد. مواد شروع کننده مولکول های DNA تک رشته ای کاملا یکسان اند. نخستین گام چسبیدن یک الیکونوکلئوتید کوتاه، به نقطه مکمل خود بر روی هر مولکول DNA تک رشته ای است. این الیگونوکلئوتید به عنوان نقطه شروع کننده (آغازگر) برای سنتز رشته پلی نوکلئوتید جدید که مکمل رشته موجود (الگو) است عمل می کند.

    روش کار تکنیک پایاندهی زنجیره

    واکنش طویل شدن زنجیره توسط آنزیم DNA پلیمراز کاتالیز می شود. این تکنیک به چهار نوع مولکول دی اکسی ریبونوکلئوتید تری فسفات (GTP ،ATP ،dCT و dTTP) به عنوان سوبسترا نیاز دارد. در حالت عادی آنزیم DNA پلیمراز قادر است یک زنجیره DNA جدید با چندین هزار نوکلئوتید را بسازد. اما در یک آزمایش توالی یابی، طول زنجیره محدود می شود. زیرا در این آزمایش ها معمولا به ازای هر نوکلئوتید یک محلول واکنش تهیه و در هر یک از آنها علاوه بر چهار نوع dNTP یک نوکلئوتید تغییر شکل یافته آن نوکلئوتید نیز به واکنش اضافه می شود.

    • نوکلئوتید تغییر شکل یافته دی دزوکسی نوکلئوتید

    این نوکلئوتید تغییر شکل یافته دی دزوکسی نوکلئوتید (برای مثال ddATP) نام دارد.  نوکلئوتیدهای تغییر شکل یافته می توانند مانند نوکلئوتیدهای معمولی در زنجیره در حال ساخت قرار گیرند. ولی به دلیل آنکه دی دزوکسی نوکلئوتید فاقد گروه هیدروکسیل در موقعیت ۳ قند است، از طویل شدن زنجیره جلوگیری می کند. از آنجا که این گروه برای پیوستن نوکلئوتید بعدی به زنجیره لازم است، به محض اینکه یک مولکول دی دزوکسی نوکلئوتید در مولکول DNA در حال ساخت وارد می شود، پایاندهی زنجیره اتفاق می افتد.

    توالی یابی سنگر

    اگر ddATP به مخلوط واکنش اضافه شود، پایاندهی زنجیره در موقعیت مقابل تیمین ها در DNA الگو رخ می دهد. اما پایاندهی معمولا در نخستین T رخ نمی دهد. چون dATP معمولی نیز در مخلوط واکنش وجود دارد و ممکن است به جای دی دزوکسی نوکلئوتید قرار گیرد. نسبت ATP به ddATP در واقع مقدار پلیمریزه شدن یک زنجیره، قبل از اضافه شدن ddATP را نشان می دهد.

    از طرف دیگر، ddATP ممکن است در اولین موقعیت تیمیدینی که با آن روبه رو می شود قرار گیرد. بنابراین خانواده ای از زنجیره های جدید با طول های متفاوت که هر یک به ddATP ختم شده اند، به وجود می آید. واکنش ساختن رشته ها در چهار حالت به طور موازی انجام می شود. بنابراین چهار خانواده متمایز از زنجیره های پلی نوکلئوتیدی تازه ساخته شده به وجود می آید که یکی از آنها شامل زنجیره هایی است که به ddATP ختم می شود. یکی دیگر به ddCTP و به همین گونه تا پایان.

    روش سنگر

    • الکتروفورز فرآورده های واکنش

    مرحله بعدی الکتروفورز فرآورده های واکنش است. هر خانواده از مولکول ها در یک چاهک از ژل آکریلامید بارگذاری می شود. و به این ترتیب مولکول های DNAایی که در یک نوکلئوتید با هم فرق دارند جدا می شوند. سپس ردیف DNA الگو بر اساس نحوه آرایش باندها که هر یک نشان دهنده قطعه ناقصی اند که در محل ورود یکی از دی دزوکسی نوکلئوتیدها خاتمه یافته اند، بر روی ژل خوانده می شود. باندی که ابتدا حرکت کند، در دورترین مکان قرار می گیرد. این باند نشان دهنده کوچکترین قطعه DNA است و در واقع رشته ای است که با ورود دی دزوکسی نوکلئوتید در اولین موقعیت خاتمه یافته است.

    الکتروفورز

    منبع: کتاب نشانگرهای مولکولی. انتشارات دانشگاه تهران.

    امتیاز شما به این مقاله چقدره؟

    میانگین امتیازات ۵ از ۵
    اشتراک‌گذاری

    دیدگاهتان را بنویسید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.