تکنیک RFLP-PCR

تکنیک RFLP-PCR، چند شکلی طولی قطعات هضم شده با آنزیم محدودگر است. که با وجود قطعاتی با طول‌های مختلف پس از هضم نمونه‌های DNA مورد نظر با اندونوکلئازهای محدود کننده خاص قابل تشخیص است. تکنیک RFLP-PCR به عنوان یک نشانگر مولکولی، خاص یک کلون تک یا ترکیب آنزیم محدودگر است. اکثر مارکرهای RFLP همبارز هستند بدین معنا که هر دو آلل در نمونه هتروزیگوت شناسایی می‌شود.

پروب RFLP PCR چیست؟

پروب RFLP چیست؟ یک توالی DNA نشاندار شده است که پس از تفکیک شدن، از طریق الکتروفورز ژل، با یک یا چند قطعه از نمونه DNA هضم شده، هیبرید می‌شود. بنابراین یک الگوی بلاتینگ منحصر به فرد را برای یک ژنوتیپ خاص در یک مکان خاص آشکار می‌کند. کلون های DNA یا cDNA ژنومی کوتاه، با یک نسخه یا تعداد نسخه کم بعنوان کاوشگرهای RFLP استفاده می شوند.

کاربرد پروب های RFLP

۱- نقشه برداری ژنوم

۲- ژنوتایپینگ،

۳- پزشکی قانونی

۴- تست تعیین هویت

۵- تشخیص بیماری ارثی و غیره

کاربرد پروب های RFLP

مراحل اجرای تکنیک RFLP-PCR

روش RFLP شامل همسانه کردن ردیف‌های منحصر به فرد یا ردیف‌هایی است که دارای نسخه‌های کمی در ژنوم هستند و به عنوان کاوشگر از آن‌ها استفاده می‌شود. ابتدا DNA ژنومی جداسازی می‌شود. برای استخراج DNA روش‌های مختلفی وجود دارد، ولی روشی برتر است که بتواند مقدار بیشتری از DNA با کیفیت مطلوب‌تر را استخراج کند. پس از استخراج، DNA را به کمک آنزیم‌ها برش داده می‌شود. کیفیت انگشت نگاری RFLP تا حد زیادی به برش کامل و دقیق نمونه‌های DNA بستگی دارد.

عوامل موثر در انتخاب صحیح آنزیم های برشی در تکنیک RFLP-PCR

تا جایی که ممکن است باید از آنزیم‌های غیر حساس به متیل‌گذاری استفاده شود.
برای یوکارت‌ها و موجوداتی با اندازه ژنوم بزرگ‌تر بهتر است از آنزیم‌های ۶ بازبر و برای پروکاریوت‌ها و ژنوم‌های کوچک‌تر از آنزیم‌های ۴ تا ۶ باز بر استفاده شود.
قیمت آنزیم‌های محدودگر متفاوت است و برخی از آن‌ها بسیار گران اند. در صورتی که ترجیح خاصی وجود نداشته باشد، از آنزیم‌های ارزان‌تر استفاده شود.

تهیه کاوشگر برای تکنیک RFLP-PCR

برای تهیه کاوشگر نیز DNA ژنومی توسط آنزیم محدودگر خاصی هضم و قطعه‌های حاصل در ناقل‌هایی (پلاسمید) که توسط همان آنزیم محدودگر برش داده شده اند، جاگذاری می‌شوند. این پلاسمیدها برای تکثیر و نگهداری به باکتری‌های آزمایشگاهی که اغلب از نوع اشریشیاکلی هستند منتقل می‌شوند. همسانه‌های یاد شده توسط رادیوایزوتوپ‌ها یا با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی پیچیده‌تر نشاندار می‌شوند. سپس به عنوان کاوشگر برای شناسایی قطعه‌هایی متناظر DNA ژنومی، نمونه‌های متعددی که با آنزیم‌های محدودگر هضم شده و بر روی ژل آگاروز از هم جدا شده و به غشاهای نایلونی یا نیتروسلولز منتقل شده اند، مورد استفاده قرار می‌گیرند.

جشنواره پاییزه

جشنواره فروش بذر های خاص و کمیاب با بیش از ۱۲۰۰ رقم تنوع

همین الآن خرید کنید

تهیه کاوشگر برای تکنیک RFLP

نحوه ایجاد چند شکلی طولی قطعات بریده شده در RFLP-PCR

اگر دو نمونه گیاهی را در نظر داشته باشیم که تنها و تنها یک نوکلئوتید آن‌ها در نقطه برش خاصی با هم متفاوت باشند، آنزیم محدودگر ویژه آن نقطه برش، DNA مستخرج از یکی از آن دو را برش خواهد داد و DNA نمونه دیگر در آن نقطه بدون برش باقی خواهد ماند. به این ترتیب قطعه‌های حاصل از برش توسط آنزیم‌های محدودگر دارای طول متفاوتی خواهند بود.

این قطعه‌ها را می‌توان براساس اندازه‌شان از طریق الکتروفورز بر روی ژل از هم جدا کرد. و پس از انتقال بر روی غشای نیتروسلوز و یا نایلونی از طریق دورگ گیری با قطعه مکمل خود (کاوشگر) که از طریق استفاده از مواد پرتوزا با روش‌های بیوشیمیایی دیگری نشاندار شده اند، قابل ثبت و مشاهده نمود.

توسعه پروب های RFLP

DNA کل با یک آنزیم حساس به متیلاسیون مانند PstI هضم می‌شود. در نتیجه کتابخانه را برای توالی‌های بیان شده با تک یا کم کپی غنی می‌کند. کلون‌های PstI بر پایه مبتنی بر متیله نبودن ژن‌های بیان شده، هستند. DNA هضم شده بر روی ژل آگارز به قطعات مختلف از ۵۰۰ تا ۲۰۰۰ جفت باز تفکیک می‌شوند. سپس شسته می‌شوند و در یک پلاسمید مانند پلاسمید pUC18 کلون می‌شوند.

پلاسمیدهای هضم شده برای بررسی درج، غربال می‌شوند. لکه‌های سادرن درج‌ها را می‌توان با DNA برش خورده برای انتخاب کلون‌هایی که با توالی‌های تک و کم کپی هیبرید شدند، کاوش کرد. پروب‌ها با استفاده از DNA ژنومی ژنوتیپ‌های مختلف هضم شده با اندونوکلئازهای محدود کننده، برای RFLP غربال می‌شوند. به طور معمول، در گونه‌هایی با میزان چند شکلی متوسط تا زیاد از دو تا چهار اندونوکلئاز محدود مانند EcoRI استفاده می‌شود.