برای بیشتر گیاهان زراعی و جانوری، اصلاح ساختار ژنتیکی موجب افزایش بسیار زیاد عملکرد و کیفیت محصول شده است. اساس بیشتر این روش های اصلاحی، ارزیابی فنوتیپی افراد و خانواده ها بوده است. پیشرفت های اخیر در بیولوژی و ژنتیک مولکولی، استفاده از فناوری های نوین در اصلاح را فراهم ساخته است. با انگشت نگاری ژنتیکی یک ژنوتیپ، این امکان وجود دارد که ارتباط بین ژنوتیپ و فنوتیپ را بررسی و پیدا کرد. بدین ترتیب امکان تعیین ژنوتیپ می تواند نقش مهمی در اصلاح گیاهان و جانوران داشته باشد. با وجود این چشم انداز، استفاده گسترده از روش های تعیین ژنوتیپ به علت محدودیت امکانات و هزینه های مربوطه میسر نیست. فناوری آرایه تنوع یا دارت یک روش جدید تعیین ژنوتیپ است که بدون نیاز به ردیف یابی و با هزینه کم می تواند به طور وسیعی به کار گرفته شود.
انگشت نگاری ژنتیکی یک جاندار در موارد زیر بسیار مفید است:
- شناسایی دقیق یک موجود و درجه خویشاوندی آن با سایر افراد (برای مثال برای مطالعه شجره نامه )؛
- شناسایی مناطق ژنومی پیوسته با صفات فنوتیپی مورد علاقه (برای مثال برای مطالعات QTL)؛
- نقشه یابی دقیق ژن های خاص به منظور جداسازی ژنها؛ و سرعت بخشیدن به برنامه های اصلاحی با غربال نتایج بر پایه ویژگی های ژنتیکی آنها؛ و ارزیابی تنوع ژنتیکی موجود؛ و ایجاد ارقام جدید؛ و تسهیل در ترکیب ژرم پلاسم های دور.
-
روش های موجود برای انگشت نگاری ژنتیکی (مثل RFLP، AFLP، SSR و SNP) محدودیت هایی دارند، از جمله :
۱- برای پوشش کل ژنوم، نیاز به شناسایی تعداد بسیار زیادی نشانگر چند شکل می باشد. با روش های موجود این کار مرحله به مرحله انجام گرفته و وقت گیر است.
۲- بیشتر نشانگرهای فوق بر اطلاعات ژنوم استوار می باشند و بهترین نتایج را برای جاندارانی می دهند که اطلاعات ژنوم آنها در دسترس باشد. بنابراین برای گیاهانی مانند برنج این روش می تواند به صورت گسترده به کار برده شود، اما برای گیاهانی با اطلاعات ژنومی محدود، کاربرد چندانی ندارد.
۳- وقتی نشانگری شناسایی می شود، هزینه استفاده از آن زیاد می گردد و سرعت کار نیز کم می شود. بیشتر این سیستم ها مبتنی بر ژل بوده و نشانگرها تک به تک رتبه بندی می شوند.
به منظور رفع مشکلات ذکر شده و کاهش هزینه های تعیین ژنوتیپ برای عموم گیاهان، فناوری تنوع آرایه ها توسط کیلیان، مدیر بخش ژنومیکس کامبیا ابداع شد.
اساس کار آرایه های تنوع
به طور کلی این روش با فراهم سازی ترکیبی از ژنوم ها (که نماینده ژنهایی اند که بر روی اسلاید قرار می گیرند) شروع می شود. پیش از قرار گرفتن ژنوم بر روی اسلاید، با استفاده از روش هایی مانند هضم آنزیمی، اتصال ساز گارساز (آداپتور) و تکثیر با استفاده از PCR (مشابه آنچه در AFLP به کار برده می شود) از پیچیدگی ژنوم کاسته می شود. حاصل این عمل را نماینده ژنوم می گویند که روی اسلاید قرار می گیرد. یک نماینده معمولا باید حاوی ۰/۱ تا ۱۰ درصد ژنوم باشد. پس از تهیه نماینده، کتابخانه ای از قطعه های همسانه شده آن ساخته می شود که به آن “پانل تنوع” می گویند. به منظور شناسایی همسانه های چند شکل در کتابخانه، قطعه های همسانه شده به طور تصادفی بر روی اسلاید قرار داده شده و با نمونه های مختلف دورگ می شوند. پس از این مرحله، قطعه های همسانه شده که چند شکلی نشان داده اند، بر روی یک اسلاید قرار می گیرند.
آرایه تنوع برنج
نخستین مقاله مربوط به آرایه تنوع توسط ژاکود و همکاران در سال ۲۰۰۱ منتشر شد. با توجه به اهمیت گیاه برنج از آن برای ارزیابی این سیستم استفاده شد. در این مطالعه، دو آزمایش اصلی صورت گرفت که در آزمایش نخست دو نماینده بر روی یک آرایه مقایسه شدند. در آزمایش دوم، یک نماینده با یک قطعه دی ان ای مشترک با تمام عناصر آرابه مقایسه شد که بدین وسیله امکان انگشت نگاری یک نمونه بدون استفاده از هر گونه نماینده از آن ژنوتیپ فراهم شد.
در این آزمایش پانل های تنوع از ترکیب دی.ان.ای ۹رقم برنج (سه ایندیکا و شش ژاپونیکا) و با استفاده از چندین آنزیم برشی و آغازگر ایجاد شدند. از این پانل برای ارزیابی مقدماتی توانایی سیستم برای شناسایی تنوع ردیف دی.ان.ا استفاده گردید. این ارزیابی مقدماتی با مقایسه جفتی چهار رقم برنج (بالا، میلین، IR64 و IR20) انجام گرفت. مقایسه بین میلین (نماینده برچسب زده با رنگ CY5) و IR64 (برچسب زده با رنگ CY3) سطح بالایی از تنوع در شدت سیگنال و نسبت سیگنال CY3/ CY5 را در میان عناصر آرایه نشان داد. هیستوگرام نسبت نرمال شدہ شدت سیگنال سبز به قرمز نشان داد که بیشتر نقاط آرایه در اطراف یک گروه بندی می گردند که به معنی شدت سیگنال مساوی برای نمونه های میلین و IR64 و نقاط یک شکل است. برای اثبات چند شکلی نشان داده شده توسط آرایه تنوع، چندین نقطه چند شکل توسط لکه گذاری سادرن تجزیه شدند که نتایج به دست آمده از آرایه تنوع را تایید کردند.
به منظور شناسایی نقاطی از آرایه که نشان دهنده قطعه های DNA چند شکل هستند، تمام ۹ رقم برنجی که برای ایجاد پانل تنوع استفاده شده بودند، بر روی اسلاید با دو تکرار تجزیه شدند. برای این آزمایش از پانل تنوعی که با آنزیم MSP1 تهیه شده بود استفاده گردید. از میان نقاطی که قابل امتیازدهی بودند، ۵۰ نقطه (۵/۱۴٪ از کل نقاط) در میان ۹ رقم تنوع نشان دادند. تمام ژنوتیپ ها برای تمام نقاط چند شکل، به صورت وجود و عدم وجود امتیازدهی شدند. قطعه های DNA ای که در تمام ژنوتیپها امتیاز مشابه داشتند، توسط ژل آگاروز مورد آزمایش قرار گرفتند. باندهایی که حرکت یکسانی بر روی ژل دارند، حاصل همسانه های تکراری اند. بدین ترتیب مشخص شد که ۲۸ نقطه از نقاط چند شکل، منحصر به فرد هستند (مکان آنها روی ژل آگاروز متفاوت است).
به طور کلی، روشی که برای کاستن پیچیدگی ژنوم در آرایه تنوع استفاده می شود مشابه با از AFLP است. اما چند شکلی که در آرایه تنوع شناسایی می شود بر اساس دورگ گیری است نه بر اساس جداسازی روی ژل. برای ایجاد نماینده می توان از روش های دیگر مانند RAPD نیز استفاده کرد. آرایه های تنوع می توانند تغییرات بازی در داخل نواحی آنزیم های برشی یا یکی از بازهای انتخابی آغازگرهای PCR (اگر استفاده شده باشد) را شناسایی کنند. همچنین این فناوری می تواند چند شکلی حاصل از حذف شدن، اضافه شدن، یا باز ترتیبی را که از فراوان ترین تغییرات دی. آن را در انسان و ژنوم های گیاهی است را شناسایی کند.
منبع : کتاب نشانگرهای مولکولی، انتشارات دانشگاه تهران
دیدگاهتان را بنویسید